流产奶牛胎儿肺炎克雷伯氏菌的分离与鉴定

叶勇刚，廖党金，张明国，康润民，肖 璐，谢 晶，曹 冶，张 涛

（1.四川省畜牧科学研究院，成都 610066；2.动物遗传育种四川省重点实验室 成都 610066；3.凉山科华奶牛繁育有限公司，西昌615099；4.凉山州畜牧兽医科学研究所，西昌 615042）

肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella peneumoniae）属肠杆菌科肠道杆菌属克雷伯氏菌种，是一种人兽共患、革兰氏阴性条件致病菌。该菌在自然界广泛分布，可存在于人、畜禽的呼吸道和消化道，一般情况下不致病，但当动物机体免疫力下降时，可引发支气管炎、肺炎、泌尿系统和创伤感染、败血症、脑膜炎、腹膜炎等[1-4]。近年来肺炎克雷伯氏菌引发的家畜疾病屡见报到，但感染奶牛的报道相对较少，尤其未见引起奶牛流产[5-8]。

2017年4月，四川攀西地区一奶牛（荷斯坦）养殖小区发生1例怀孕7个月奶牛流产，母牛出现子宫内膜炎及疑似瘫痪症状，采用补钙和一般抗生素治疗后，效果不良。本研究从无菌采集的胎儿腹水和心血中分离到1株革兰氏阴性短杆菌，通过微生物分离纯化、生化鉴定、16S rRNA 扩增测序、小鼠致病性试验鉴定该菌株为致病性肺炎克雷伯氏菌，并根据药敏试验的结果，给予母牛治疗，最终母牛得以治愈。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 麦康凯琼脂培养基、鲜血琼脂培养基、抗生素药敏纸片和微量生化反应管均购自杭州微生物试剂有限公司；Mueller-hinton agar和Mueller-hinton BROTH购自上海叶舟生物科技有限公司；2×TaqPCR Mastermix和凝胶回收试剂盒购自天根生化科技有限公司；D2000 Plus DNA ladder购自中科瑞泰生物科技有限公司。

1.1.2 病料和试验动物 流产胎儿组织样本来自四川攀西地区某奶牛养殖小区；40 d昆明鼠购置四川成都达硕实验动物有限公司。

1.1.3 引物 16S rRNA通用引物 27F: 5'-AGAGTTTG ATCCTGGCTCAG-3'；1492R: 5'-GGTTACCT TGTTACGACTT-3'；16S～23S rRNA 通用引物（Jensen等[9]设计）F: 5'-GAAGTCGTAGTAA CAAGG-3'；R: 5'-CAAGGCATCCACCGT-3'。引物由成都擎科梓熙生物技术有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 细菌的分离纯化 用接种环无菌采集流产胎儿心血和腹水接种于肉汤培养基中，带回实验室37℃培养，过夜后于超净台无菌涂于血琼脂培平板上分离单菌落，并对分离株纯培养细菌进行革兰氏染色，观察细菌个体形态，然后接种于麦康凯培养基观察其培养特征。

1.2.2 生化试验 将分离纯化的细菌接种于普通营养琼脂中，培养 24 h并按照微量生化管说明书进行生化试验。

1.2.3 16S rRNA和16S～23S rRNA 核苷酸序列鉴定挑取单菌落溶于10 μL ddH2O混成菌液作为DNA模板。反应体系（20 μL）：DNA模板(菌液)1 μL，PCR Mstermix 10 μL，dd H2O 7 μL，上下游引物各1 μL（50 ng/μL）。PCR反应条件：94℃ 预变性2 min，94℃变性30 S， 55℃退火30 S，72℃ 延伸1 min，30个循环；72℃ 延伸10 min。扩增产物经10 g/L 琼脂糖凝胶电泳后回收，纯化后送成都擎科梓熙生物技术有限公司测序，将测序结果在 NCBI上进行BLAST 比对鉴定。

1.2.4 药敏试验 采用纸片琼脂扩散方法，对常见的28种抗生素进行药敏试验，结果参照 national committee clinicallaboratory standards（NCCLS）药敏试验标准按敏感、中度敏感和耐药进行判定。

1.2.5 致病性试验 挑取分离纯化的单菌落于Muellerhinton BROTH培养基中35℃摇菌培养过夜，部分用比浊管按1.2×109cfu/mL稀释。将小白鼠分为4个组，每组5只，第1组于腹腔接种培养过夜原菌液0.2 mL；第2组于腹腔接种浓度为1.2×109cfu/mL菌液0.2 mL；第3组为对照组，于腹腔接种MH培养基0.2 mL；第4组为对照组，不接种任何物质。

2 结果

2.1 细菌分离培养在麦康凯培养基和血琼脂平板培养基上均长出1～2 mm的黏液状菌落，经革兰氏染色后，镜检见革兰氏阴性短杆菌，两端钝圆，见图1。

2.2 生化特性该菌能分解葡萄糖和乳糖，分解葡萄糖能产酸产气，能还原硝酸盐，分解尿素，V-P试验呈阳性。该分离菌的生化特征基本与报道的肺炎克雷伯氏菌一致[10]，具体见表1。

2.3 16S rRNA和16S～23S rRNA基因鉴定16S rRNA基因扩增结果显示，PCR扩增片段位于1000～2000 bp（见图2A）。BLAST结果显示，分离菌株的16S rRNA基因序列与肺炎克雷伯氏菌 16S rRNA基因序列的同源性为 99%，16S～23S rRNA基因扩增结果显示，该PCR扩增出3个片段（见图2B），测序结果表明该分离株的16S～23S rRNA序列与肺炎克雷伯氏菌的16S～23S rRNA同源性最高。以上结果表明，该分离细菌为肺炎克雷伯氏菌。

图1 肺炎克雷伯氏菌革兰氏染色Fig.1 Gran staining of Klebsiella pneumoniae

表1 细菌生化鉴定结果Table 1 The results of biochemical test of the bacteria

图2 16S rRNA (A)和 16S～23S rRNA(B)基因的PCR扩增Fig.2 The PCR ampli fication of 16S rRNA (A) and 16S～23S rRNA gene(B)

2.4 药敏试验在选用的常见28种抗生素中，该分离菌株对氨苄西林、头孢曲松、头孢唑林、多粘菌素等16种抗生素敏感；对多西环素、四环素、新霉素等7种抗生素中度敏感；对青霉素、苯唑西林、红霉素、米诺环素和氯唑西林耐药，具体见表2。

2.5 动物试验接种0.2 mL原菌液组的小鼠于24 h内全部死亡，接种0.2 mL 1.2×109cfu/mL菌液组小鼠于36 h内全部死亡；而对照未见任何临床症状。解剖小鼠，可见其肺脏、胸腔有明显出血，腹腔有大量积液；取腹腔积液或胸腔积液进行染色镜检，均可见大量革兰氏阴性短杆菌，与犊牛分离病原菌形态一致。

3 讨论

PCR和DNA碱基测序技术用于鉴定细菌种类具有快速、准确的优势，现已经广泛用于对未知菌种进行检测。其中16S rRNA和16S～23S rRNA 编码的基因序列具有高度保守和变异的特性，是用于鉴定细菌的理想靶序列[11,12]。16S rRNA适合于细菌属内种间的鉴定，在分类学中被誉为“金标准”，但由于进化慢，序列相对保守，对相近种或同一种不同型之间进行鉴别存在一定缺陷，如大肠埃希菌与宋内志贺菌、炭疽杆菌与蜡样芽胞杆菌的16S rRNA序列相同，因此无法用此基因片段进行鉴别[13]。而16S～23S rRNA间隔区序列（intergenic spacer region，ISR）除保守外，其进化速度高于16S rRNA的10倍，能对相近菌种和同种内的不同菌株进行鉴别，成为细菌分类和鉴定的热点[14]。本试验采用16S rRNA通用引物，成功扩增了16S rRNA基因片段，通过测序确定了该分离菌株为肺炎克雷伯氏菌。此外，本研究还借鉴了Jesen等[9]设计的经典引物对本株肺炎克雷伯氏菌进行扩增，扩增结果显示在250～500 bp间出现3条带的特异性图谱，测序结果同样证明了该分离菌株为肺炎克雷伯氏菌。

据报道，肺炎克雷伯氏菌可产生各种使抗生素失活的酶，如产生β-内酰胺酶、头孢菌素酶和碳青霉烯酶；此外，肺炎克雷伯氏菌还可通过缺失菌体外模蛋白、改变抗生素作用靶位，以及产生生物膜等机制产生耐药[15]。畜禽生产过程中，抗生素作为促生长的饲料添加药物和临床不合理使用抗生素，使畜禽肺炎克雷伯氏菌产生了严重的耐药性。

表2 药敏试验结果Table 2 The result of drug sensitive test

肺炎克雷伯氏菌引发的疾病越来越常见，现均能从人、牛、羊、猪、皮毛动物等中分离到致病性肺炎克雷伯氏菌。肺炎克雷伯氏菌感染奶牛主要造成奶牛乳房炎、肺炎、子宫内膜炎，也有报道在流产奶牛胎儿中分离到肺炎克雷伯氏菌，但其不是造成奶牛流产的主要病因[16,17]。本试验从流产奶牛胎儿心血和腹腔液中分离到1株细菌，采用16S rRNA基因扩增测序、生化鉴定等方法确定该分离菌株为肺炎克雷伯氏菌，小白鼠感染试验证明其具有很强的致病力；加之没有分离到其他的病原菌，由此判断，可能是孕牛免疫力低下，肺炎克雷伯氏菌乘机在孕牛体内大量繁殖而引起奶牛发病和流产，病原菌经垂直传播给胎儿。另外试验还通过药敏试验，筛选出敏感性药物并对临床生产进行指导用药，取得了较好的治疗效果，进一步证明了该奶牛的流产与肺炎克雷伯氏菌相关。肺炎克雷伯氏菌作为一种人兽共患病原菌，奶牛场应加大对该类疫病的预防，除科学使用抗生素外，还需加强卫生消毒，加强饲养管理，用药前多做相关药敏试验，实施针对性用药，提高防治效果。