鸭甲型肝炎病毒的遗传和抗原稳定性分析

马秀丽，黄 兵，李玉峰，于可响，刘存霞，胡 峰，亓丽红，宋敏训，艾 武

（山东省农业科学院家禽研究所 山东省禽病诊断与免疫重点实验室，济南 250023）

鸭甲型肝炎病毒（Duck hepatitis A virus，DHAV）归属于小RNA病毒科禽肝炎病毒属，DHAV主要危害3周龄以下的雏鸭，死亡率高达80%以上，给养鸭业造成巨大危害[1]。DHAV包括三个血清型，即DHAV-1，DHAV-2和DHAV-3[2]。DHAV-1的危害普遍存在于全国各地，近年来，DHAV-3的流行有增加的趋势，个别鸭场还会出现DHAV-1和DHAV-3混合感染的现象，而DHAV-2仅在台湾发生过[3]。三者均具有典型小RNA病毒的基因组结构，但三者之间存在显著的序列差异，遗传进化关系表明三者属于三个不同的基因型，即基因A型、基因B型和基因C型，血清学试验证明三者之间无交叉反应[4,5]。随着DHAV-1和DHAV-3的危害日趋严重[6-15]，该病的遗传变异和抗原稳定性备受大家的关注。为进一步分析当前DHAV的流行特点和变异现状，本研究对本实验室保存的25株DHAV-1（2000年～2017年）和32株DHAV-3（2008年～2017年）以及Genbank中下载的DHAV代表株的VP1基因进行了生物信息学分析，结合代表毒株的生物学特性，进一步揭示了DHAV-1和DHAV-3的抗原特性和变异情况，对我国今后鸭甲型肝炎病毒的综合防控具有重要的指导意义。

1 材料与方法

1.1 DHAV毒株和阳性血清本实验室分离保存的25株DHAV-1（表1）和32株DHAV-3（表2）均由本实验室分离保存；1-CL/03、1-HA5/13、3-FX/08和1-HC5/13单因子阳性血清由本实验室制备并保存。

表1 DHAV-1毒株背景Table1 DHAV-1 strains used in this study

（续上表）

表2 收集的DHAV-3毒株背景Table2 Summary of DHAV-3 strains used in this study

1.2 DHAV VP1基因的扩增参考Genbank中已发表的DHAV-1和DHAV-3 VP1基因序列，分别设计1对扩增DHAV-1、DHAV-3VP1基因异性引物。DHAV-1-F：5'- CTCGAGGGTGATTCTAACC AGTT-3'，DHAV-1-R：5'-GCGGCCGCTTCA ATTTCCAGATT- 3'（下划线碱基为酶切位点）；DHAV-3-F：5'- CTCGAGGGTGATTCCAATC AGCT- 3'，DHAV-3-R：5'- GCGGCCGCTTC AATYTCCARAT- 3'（下划线碱基为酶切位点）。采用Trizol方法提取病毒RNA后，按常规RT-PCR方法扩增DHAV毒株的VP1基因，并将回收的PCR产物克隆至pMD18-T载体中，双酶切法筛选出阳性重组子，送北京博尚生物有限公司进行VP1基因序列测定。

1.3 DHAV VP1蛋白的遗传进化分析采用MEGA6.0软件对测定的DHAV毒株与Genbank中下载的VP1基因（表3）的核苷酸和氨基酸序列进行比较，用Boot-strap法（Replication值为1000）计算遗传距离并绘制N-J进化树，分析当前国内DHAV的流行情况及不同毒株氨基酸的变异程度。

表3 Genbank中下载的DHAV-1和DHAV-3序列Table 3 Reference sequences of DHAV-1 and DHAV-3 from Genbank

1.4 血清交叉中和试验采用固定病毒稀释血清方法进行交叉中和试验。将自制的1-CL/03、1-HA5/13或3-FX/08、3-HC5/13单因子血清分别与等体积的病毒含量为200ELD50/0.1mL的DHAV代表毒株（2016年和2017年）混合，充分作用后分别接种非免鸭胚，37℃温箱培养，记录结果，用Reed和Muench两氏法计算血清中和指数。

2 结果

2.1 DHAV VP1基因的序列分析对实验室DHAV-1、DHAV-3毒株的VP1基因序列分析发现，DHAV-1间的VP1基因的核苷酸序列相似性为91.7%～99.9%；DHAV-3间的VP1基因的核苷酸序列相似性为90.7%～99.6%；DHAV-1和DHAV-3间的VP1基因核苷酸序列相似性为70.0%～73.5%；因此VP1蛋白序列同源性在DHAV分型上起主要作用。DHAV-1和DHAV-3的VP1存在一些氨基酸变异位点，主要集中在143～147位，171～201位，204～212和217～224位。氨基酸变异位点的存在导致了DHAV-1和DHAV-3抗原性的差异，从而使得DHAV-1与DHAV-3的交叉反应性很低或无交叉中和反应[3,5]。选取DHAV-1代表株1-CL/03和1-HA5/13，与1-JSDH/16、1-HZYC/16和1-GD/17分离毒株之间比较，结果发现存在5处氨基酸位点的改变（181位、184位、193位、219位和238位）。选取DHAV-3代表株3-FX/08和3-HC5/13，与2016 ～2017年DHAV-3分离毒株进行比较，发现存在9处氨基酸位点的改变（21位、48位、159位、188位、195位，196位、205位、239位和240位），结合血清中和试验结果，表明这些氨基酸位点的改变没有影响DHAV-1或DHAV-3的中和特性。

2.2 遗传进化分析根据绘制的系统发育树可以看出，DHAV-1进化为两个大分支（图1），一个分支为2013年以前的分离毒株，另一分支为近几年的分离毒，其中2013年的分离毒1-HA5/13也分布在这个分支上，表明2016～2017年分离毒与1-HA5/13遗传距离较近。DHAV-3也进化为2个大分支（图2），一个分支为经典的毒株3-AP04114/03、3-B63/08和3-NC/09，另一个分支为实验室2008～2017年分离毒株和福建分离毒株3-G/99，其中实验室分离毒又进化为一单独的亚分支。

2.3 DHAV血清交叉中和试验由图3可见，3株DHAV-1分离株（1-JSDH/16、1-HZYC/16、1-GD/17）针对1-CL/03和1-HA5/13血清的中和指数均在100以上，均可判为阳性。3株分离毒与1-CL/03和1-HA5/13血清的中和指数差异较大，可能与这2份血清自身效价差异较大有关。由图4可见，10株DHAV-3分离株针对3-FX/08和3-HC5/13血清的中和指数均在100以上，均可判为阳性，表明各毒株之间有较好的交叉反应。

图1 DHAV-1遗传进化关系分析Fig.1 Genetic and phylogenetic analysis of DHAV-1

图2 DHAV-3遗传进化关系分析Fig.2 Genetic and phylogenetic analysis of DHAV-3

图3 1-CL/03和1-HA5/13针对DHAV-1不同毒株的中和指数Fig. 3 Neutralization index of different DHAV-1 strains against serum 1-CL/03 and 1-HA5/13

图4 3-FX/08和3-HC5/13针对DHAV-3不同毒株的中和指数Fig. 4 Neutralization index of different DHAV-3 strains against serum 3-FX/08 and 3-HC5/13

3 讨论

3.1 DHAV遗传进化分析本文根据DHAV-1和DHAV-3 VP1基因的遗传进化分析发现，在过去16年内，DHAV-1进化为两个主要分支，分支1a包括2000～2013年流行的20个毒株，另一个分支1b包括2013～2017年流行的5个毒株。我们又进一步分析这两个分支上DHAV-1的地理分布差异，结果发现，来源于同一地区的毒株在两个分支中均存在，这可能与当前家禽频繁的贸易往来有较大关系。过去8年内DHAV-3进化为两个遗传分支，其中分支3b只有2003～2009年分离的3个毒株，1个毒株来自韩国（3-AP04114/03），1个毒株来自越南（3-NC/09），1个毒株来自中国北京（3-B63/08）。另一个分支3a为本研究中分离的DHAV-3毒株与福建毒株3-G/99，DHAV-3分离毒株占据单独的一个亚分支，有趣的是这些毒株又进一步分化成更小的亚分支，其中2012-2017年的大多数毒株集中在一个亚分支上。另一个亚分支上只有福建毒株3-G/99，由此可见我国早在1999年就有DHAV-3的存在。DHAV-3毒株之间无明显的地理分布差异。

3.2 DHAV-1和DHAV-3的血清学特征我们选取DHAV-1和DHAV-3两个分支上的代表毒株制备的阳性血清1-CL/03、1-HA5/13、3-FX/08和3-HC5/13，分别与近两年分离的DHAV-1和DHAV-3毒株进行血清交叉中和试验，其主要目的是分析DHAV遗传多样性对抗原性的影响。结果表明，过去16年的DHAV-1和8年的DHAV-3的抗原性相对稳定，相同血清型之间有很好的交叉保护，DHAV疫苗仍能中和当前流行的相同血清型的DHAV毒株，说明现有DHAV疫苗完全能够保护相同血清型的DHAV的感染。

总之，在过去16年中，DHAV的遗传性和抗原性相对稳定。尽管DHAV-3的进化速度远快于DHAV-1[16]，目前来看DHAV-3的高进化速率并未造成该血清型病毒抗原性的改变。但上述研究结果提示我们应做好DHAV的流行病学监测，防止潜在的遗传变异导致病毒逃逸而引发疫病的暴发和流行。