大鼠细小病毒VP2原核表达及间接ELISA方法建立

霍 娜，姚 威，于婉琪，魏晓锋，萧 飒, 陈鸿军

（1. 西北农林科技大学，杨凌 712100；2. 中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241；3.上海实验动物研究中心，上海 2012033）

大鼠细小病毒（Rat parvovirus，RPV）是对实验大鼠危害最为严重的病毒之一，属单股线状无囊膜DNA病毒，分类上属细小病毒科，细小病毒属，包括Kilham大鼠病毒（Kilham rae parvovirus，KRV），Toolan病毒（Toolans H-1 virus），大鼠细小病毒a型（RPV-1a）和大鼠微小病毒（Rat minute virus，RMV）4种毒株[1,2]。RPV在实验大鼠和野生大鼠中有较高的感染率，无任何临床症状和病理变化，但在细胞内持续性感染，并可致种鼠群繁殖率下降，污染肿瘤移植物和细胞系，对实验研究造成严重干扰，是实验动物国标中SPF级大鼠病毒必检项目之一[2-4]。

RPV的VP蛋白是结构性或衣壳蛋白，包括VP1、VP2和VP3。VP1是次要衣壳蛋白，其编码序列包含特殊的N端残基和VP2蛋白。而VP2是主要的衣壳蛋白，参与衣壳组装，释放大约85%的病毒粒子。VP2蛋白还决定了人肿瘤细胞对于H-1毒株的易感性。VP3蛋白是VP2的裂解产物[5-7]。

为检测大鼠细小病毒、大鼠微小病毒和细小病毒NS-1株感染的抗体水平，本研究参考这3种病原基因组DNA序列，设计引物，克隆大鼠细小病毒VP2抗原的特异性表位，原核表达后，以纯化蛋白为包被抗原，建立间接ELISA方法，可有效地用于大鼠细小病毒血清抗体检测。

1 材料与方法

1.1 质粒、菌种及试剂表达载体pET30a、大肠杆菌BL21（DE3）由本实验室保存。Balb/c小鼠购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司。

1.2 血清和试剂大鼠细小病毒RPV、H-1和KRV毒株阳性血清和待检血清由上海实验动物研究中心提供。RPV VP2小鼠单克隆抗体2E7由本实验自制。HRP标记羊抗大鼠IgG（H+L）购自上海翊圣生物科技有限公司；Phanta®Max Super-Fidelity DNA聚合酶购自南京诺唯赞生物公司，T4 DNA连接酶、限制性内切酶BamH I、XhoI均购自英国NEB公司，其他试剂均为分析纯。

1.3 VP2基因克隆及原核表达

1.3.1 基因分析与引物设计 根据NCBI发表的大鼠细小病毒RPV（GenBank登录号：ACV32720）、H-1株（GenBank登录号：AFR44451.1）、KRV株（GenBank登录号：AAB38328.1）、RMV（GenBank登录号：AGG38825）和MVM株（GenBank登录号：ABB01355.1）的VP2蛋白序列进行比对分析，找出了一段特异的378 bp片段编码RPV-VP2的成熟肽：5'-ATGGCTGCTAGA GTTGAGAGAGCAGCTGACGGCAGTGGAGGC TCTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTAATGGTG GTGTTGGGGTTTCTACGGGGAGCTTTGATAA CCAAACGCACTATGACTTCCTTGGAGGGGGG TGGGTCCGTATCACAGCGTATGCTTCGCGAC TTGTTCATATAAATATGCCTGCTTCTGAAGA GTACCATAGAATTTTTGTTAGAAATAATACT GATACTGGTCAAAAGGGAAAGATGTCTTTG GATGATGTGCACACACAGATCTGGACTCCAT GGAGTCTGGTAGATGCTAATGCATGGGGCT GTTGGTTTCAGCCAAGTGACTGGCAGTTTAT TCAAAACTCTATGGCTGAACTTAATCTT-3'。根据该序列设计特异性引物，上游引物序列：5'-CGCGGATCC ATGGCTGCTAGAGTTGAGAGAG-3'，下游引物：5'-GCCCTCGAG TCAAAGATT AAGTTCAGCCATAG -3'，下划线分别为BamH I和XhoI位点，斜体部分为保护性碱基。

1.3.2 VP2基因的扩增与克隆 以合成的基因为模板，特异性引物扩增VP2基因，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR反应产物。纯化后与pET30a载体连接，酶切鉴定正确后命名pET30a-VP2，重组质粒送至苏州金唯智公司进行测序。

1.3.3 重组蛋白的诱导表达与纯化鉴定 将测序正确的pET30a-VP2重组质粒接种于Kan+抗性培养基中，37℃培养至OD值达为0.6～0.8时，加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG，37℃诱导约8 h。同时设pET30a载体为空白对照。于4℃离心收集细菌培养物，进行15% SDS-PAGE鉴定。确认表达后利用Ni-琼脂糖凝胶6FF(His标签纯化树脂）对表达产物进行纯化, 具体方法按说明书进行。纯化后产物进行SDS-PAGE和免疫印迹分析，用本实验室制备的VP2单克隆抗体作为一抗，二抗为HRP标记的羊抗鼠IgG，用ECL发光液显色。

1.4 小鼠阳性血清的制备纯化后的VP2蛋白与等体积完全弗氏佐剂混合并完全乳化，腹腔注射，50 μg/只免疫6周龄的Balb/c小鼠；7 d后二免，免疫途径、剂量同一免，用弗氏不完全佐剂；14 d后三免，不加佐剂，腹腔注射，50 ug/只。5 d后收集血清测抗体效价。

1.5 间接ELISA方法的建立

1.5.1 最佳抗原包被浓度和血清稀释度的确定 采用方阵滴定法将纯化的VP2重组蛋白用pH9.6的碳酸盐缓冲液按照1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1000、1∶2000、1∶4000的梯度稀释，每个稀释度包被一竖行，100 μL/孔，4℃包被过夜；次日弃液，TBST洗涤3次，5 min/次，甩干；5%脱脂奶粉37℃封闭2 h；弃脱脂奶，洗涤同上，甩干；小鼠阴阳性血清分别按照1∶200、1∶500、1∶1000、1∶2000、1∶4000、1∶8000、1∶16 000的梯度稀释，每个稀释度加一横行，100 μL/孔，37℃孵育60 min；洗板同上，甩干；加入羊抗鼠酶标二抗（1:5000），100 μL/孔，37℃孵育45 min；洗板同上，甩干；加入100 μL/孔TMB显色液，室温避光显色15 min；最后加入50 μL/孔2 mol/L H2SO4终止显色；酶标仪测定OD450。以P/N值最大的稀释度为抗原与血清的最佳稀释度。

1.5.2 临界值的确定 将经进口全病毒间接ELISA试剂盒判定为阴性的55份大鼠血清在最适反应条件下，按问接LISA程序进行测定，求出OD450平均值X和标准差SD。根据统计学原理，OD450≥ X+3SD时，判为阳性；OD450＜ X+3SD时，判为阴性。

1.5.3 交叉反应试验 以纯化重组蛋白作为抗原包被ELISA板，检测H-1、KRV阳性血清，确定重组抗原与其他大鼠病毒阳性血清是否发生交叉反应。

1.5.4 敏感性试验 将RPV毒株阳性血清按照1∶50、1∶100、1∶500、1∶1000、1∶2000、1∶4000、1∶8000的梯度稀释，检测建立的间接ELISA方法的灵敏度。

1.5.5 重复性试验 (1)批内重复试验：抽取血清样品10份，每份血清样品平行做5孔，用建立的间接ELISA方法检测，计算其变异系数。(2)批间重复试验：在相同的试验条件下，用2批重组VP2包被ELISA板，对10份血清进行ELISA检测，计算其变异系数。

1.5.6 样品检测 采用本试验建立的iVP2-ELISA方法对上海实验动物中心提供的165份待检血清进行检测，计算样品阳性率。

2 结果

2.1 VP2重组蛋白的表达与纯化鉴定将合成的VP2片段克隆入pET30a载体中，挑取测序正确的重组菌，经IPTG诱导表达，SDS-PAGE结果见图1A。0.5 mmol/LIPTG诱导的重组菌在20 kDa左右处可发现特异性的条带。经His镍柱纯化后可见明显的单一表达条带，纯化后的重组蛋白经Bradford法测定浓度为0.28 mg/mL。将纯化后产物和空载体菌转移至NC膜，利用本实验室制备的2E7单抗进行Western blot检测，结果图1B。在20 kDa左右，重组纯化蛋白具有明显的反应条带。

2.2 间接ELISA方法的建立

2.2.1 最佳抗原包被浓度和血清稀释度的确定 方阵实验结果表明，当抗原包被最佳稀释倍数为1∶1000（此时蛋白质量浓度为0.28 μg/mL）、待检血清以1∶2000稀释时，P/N值最大，结合阴阳性血清的OD450值，确定抗原最佳包被质量浓度为0.28 μg/mL（即28 ng/孔），血清最适稀释度为1:2000。

2.2.2 临界值的确定 用初步确定的条件，对55份（1∶100倍稀释）RPV阴性血清样本的OD450测定后计算得平均值X和标准差SD分别为0.263与0.079。计算出RPV VP2间接ELISA的判断标准：样本 OD450≥0.5为阳性；样本OD450＜0.5为阴性。

2.2.3 交叉反应试验 采用iVP2-ELISA方法检测H-1、KRV阳性血清，结果见表1。结果表明, 上述血清均为阳性，说明制备的VP2抗原与上述病原存在一定的交叉反应。

2.2.4 敏感性试验 采用建立好的iVP2-ELISA方法检测不同稀释倍数的RPV阳性血清时，可看出当阳性血清稀释到2000倍时仍能检测到（表2），表明本实验建立的ELISA检测方法灵敏度较高。

2.2.5 重复性试验 （1）批内重复性试验：选取10份血清样品，用建立的VP2-ELISA进行5次批内重复检测，结果见表3。批内重复性试验的变异系数集中在2.175%～5.567%，表明建立的检测方法具有较好的重复性。（2）批内重复性试验：用建立的VP2-ELISA，取10份血清样品分别用3个不同批次包被的酶标板进行检测，结果见表4。3次检测的阴、阳性结果完全一致。

图1 SDS-PAGE和Western blot检测pET30a-VP2重组蛋白的表达与纯化Fig.1 Identi fication of the recombinant protein by SDSPAGE and Western blotting analysis

表1 交叉反应试验结果Table 1 The result of cross-reaction

表2 敏感性试验结果Table 2 The result of sensitivity test

表3 批内重复性试验结果Table 3 The result of intra-assay of indirect ELISA

表4 批间重复性试验结果Table4 The result of inter-assay of indirect ELISA

2.2.6 样品检测结果 采用本试验建立的iVP2-ELISA方法对上海实验动物中心提供的165份待检血清进行检测，编号为31的样品为阳性，阳性率为0.61%。

3 讨论

RPV在鼠群中感染非常普遍，且可长期带毒，这给动物生产和动物实验带来了严重干扰。因此，研制一种操作简便、快速、敏感性高、特异性好，适用于检测大规模样品的ELISA诊断方法具有重要意义。

细小病毒的VP2蛋白是一种重要的结构蛋白，能诱导宿主产生免疫应答[8]。有报道显示，缺失VP2基因的猪细小病毒突变体均丧失了对宿主细胞的再感染性，而且VP2蛋白是PPV中和抗体的靶蛋白[9,10]。Ball-Goodrich 等[5]研究结果表明在RPV的感染过程中大鼠体内产生了抗VP2蛋白的特异性抗体。因此，VP2在诊断细小病毒的感染和对其进行免疫预防都具有重大意义。

本研究分析比对大鼠细小病毒RPV株、H-1株、KRV株、RMV和MVM株的VP2蛋白序列，原核表达了一段特异的RPV-VP2成熟肽，以纯化表达产物为抗原，建立间接ELISA方法。该方法在重复性和敏感性方面优于HI法, 且血清样品不需特殊处理和特殊设备，适于大批量样品的检测[11,12]。

但是，本研究也存在一定的不足，因为所选取的靶蛋白氨基酸序列与KRV、H-1、MVM和RMV株的同源性在70%～79%，所建立的iVP2-ELISA方法对于H-1和KRV株的阳性血清存在轻微的交叉反应。其次，以原核表达产物为包被抗原所建立的间接ELISA法极易受到原核表达系统中杂蛋白成分的干扰而产生假阳性结果，降低了方法的特异性。为弥补这些不足，本研究还在制备多株VP2单抗，拟在下一步将VP2单抗作为竞争抗体，建立检测大鼠细小病毒中和抗体的阻断ELISA检测方法。该方法能大大提高检测抗体的特异性，为大鼠细小病毒、大鼠微小病毒和细小病毒感染的鉴别诊断提供可靠的技术基础。