GEL 01佐剂联合猪支原体肺炎活疫苗黏膜接种的效果评估

张珍珍，韦艳娜，王 佳，王海燕，熊祺琰，邵国青，冯志新

（江苏省农业科学院兽医研究所 农业部兽用生物制品工程技术重点实验室，南京210014）

猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae）是引起猪支原体肺炎的重要病原，给养猪产业造成严重的经济损失[1,2]。目前，疫苗接种是有效防控猪支原体肺炎的重要方式[3]。猪肺炎支原体入侵机体的主要场所是呼吸道，可引起气管上皮损伤等一系列呼吸道病变[4]。由于猪支原体肺炎的免疫应答主要以局部免疫为主，猪肺炎支原体活疫苗通过黏膜途径免疫可以诱导有效的局部黏膜免疫应答[5]，从而发挥比灭活疫苗更优的免疫保护效果。目前滴鼻免疫和气雾免疫等方式已被用于猪肺炎支原体活疫苗黏膜免疫途径的开发[6,7]。

猪肺炎支原体免疫原性相对较弱，开发适合猪肺炎支原体活疫苗的佐剂，对于进一步提高猪肺炎支原体活疫苗的免疫保护力以及新型疫苗的研制有重要意义。例如CpG佐剂可以增强猪肺炎支原体弱毒株鼻腔免疫效果，增强仔猪细胞免疫和体液免疫应答[8]。Gel 01是白色、不透明、可流动的凝胶，主要成分为丙烯酸，已被研发用于动物水性疫苗佐剂[9]。Deville等[10]研究表明Gel 01佐剂可增强活疫苗经黏膜免疫途径的免疫保护效果，但Gel 01佐剂用于猪支原体肺炎活疫苗黏膜接种的免疫效果尚未有报道。本研究采用Gel 01联合猪支原体肺炎活疫苗滴鼻免疫小鼠，检测其免疫效果，以期为猪肺炎支原体活疫苗黏膜佐剂的筛选提供实验基础。

1 材料和方法

1.1 主要实验材料水佐剂 MontanideTMGel 01购自法国 Seppic 公司；雌性BALB/c小鼠购自扬州大学医学比较中心；猪支原体肺炎（168株）活疫苗（批号：20170518）由本实验室制备提供；小鼠IL-4 ELISA检测试剂盒、小鼠IFN-γ ELISA 检测试剂盒和小鼠IL-17 ELISA检测试剂盒购自武汉基因美生物科技有限公司；TMB显色液购自碧云天生物技术有限公司；小鼠IgG抗体购自武汉博士德生物公司；小鼠IgA、IgG1、IgG2a抗体购自BETHYL公司。

1.2 动物分组及免疫BALB/c雌性小鼠，随机分成3组，每组20只，分别以50 μL/只含Gel 01（终浓度为20%）的猪支原体肺炎（168株）活疫苗（107CCU）和生理盐水无佐剂的猪支原体肺炎（168株）活疫苗的生理盐水滴鼻小鼠。首免14 d后加强免疫1次。

1.3 抗体检测在末次免疫后第7 d、21 d、35 d和49 d分别对小鼠进行眼框采血，1000×g离心15 min，分离血清，检测小鼠血清中IgG、IgG1和IgG2a抗体水平。在末次免疫后第21 d和第49 d取小鼠支气管肺泡灌洗液（BALF），300×g离心10 min，收集上清，检测其中sIgA、IgG、IgG1和IgG2a抗体水平。

1.4 细胞因子检测在免疫后第21 d、49 d，收集小鼠血清和BALF，离心后收集上清。根据ELISA 试剂盒说明检测血清和支气管肺泡灌洗液（bronchoaveolar levage fluid，BALF）中IL-4、IL-17、IFN-γ 的含量。

1.5 小鼠淋巴细胞增殖测定在免疫后第21 d，无菌分离小鼠脾脏淋巴细胞，细胞浓度调整至5×106个/mL，接种于96孔板中，每孔100 μL，分别加入5 μg猪肺炎支原体全菌抗原溶液（抗原刺激组）、5μL PBS溶液(阴性对照组)、2.5 μg刀豆蛋白溶液（阳性对照组），每组设4个复孔。培养72 h后，加入10 μL的CCK-8溶液，孵育4 h后在450 nm测定吸光度。以纯培养基的孔为空白对照孔。刺激指数=(抗原刺激孔OD值-空白对照孔OD值)/(PBS刺激孔OD值-空白对照孔OD值)

1.6 数据分析数据采用Graphpad软件进行统计学分析，结果以均数±标准差表示，组间比较采用t检验分析，P＜0.05表示有显著性差异。

2 结果

2.1 Gel 01联合疫苗黏膜免疫对小鼠局部体液免疫水平的影响Gel 01与猪支原体肺炎（168株）活疫苗滴鼻免疫小鼠后，检测支气管肺泡灌洗液（BALF）中IgG抗体及亚型的变化，结果见图1。与疫苗组相比，末次免疫第21 d、49 d时，Gel 01+疫苗组能够显著提高BALF中活疫苗特异性IgG、IgG1和IgG2a抗体水平（p＜0.05），但对IgG1/IgG2a无显著影响。同时检测了BALF中黏膜抗体sIgA的含量，与疫苗组相比，Gel 01+疫苗组能显著增强sIgA抗体水平（p＜0.05）。以上结果表明Gel 01与疫苗共同滴鼻能显著增强小鼠的局部体液免疫反应。

图1 ELISA检测小鼠免疫后BALF中抗体水平Fig. 1 ELISA detection of antibodies in mice BALF post immunization

2.2 Gel 01联合黏膜疫苗免疫对小鼠局部细胞免疫的影响检测Gel 01联合疫苗免疫后，BALF中Th1（IFN-γ）、Th2（IL-4）和Th17（IL-17）型细胞因子含量的变化，结果见图2。疫苗组的IFN-γ、IL-4和IL-17含量于对照组相比无显著性差异，而Gel 01+疫苗组能显著升高BALF中IFN-γ、IL-4和IL-17的含量（p＜0.05）。以上结果表明Gel 01可以增加Th1、Th2和Th17型细胞因子的表达，激活黏膜局部细胞免疫。

2.3 Gel 01联合疫苗黏膜免疫对小鼠全身体液免疫水平的影响Gel 01与猪支原体肺炎(168株)活疫苗滴鼻免疫小鼠后不同时间点检测其血清中抗体水平，结果见图3。对照组不能诱导产生活疫苗特异性IgG抗体；疫苗组在免疫后第21 d IgG抗体水平达到峰值，与对照组相比有显著性差异（p＜0.01）；而Gel 01+疫苗组能够显著提高血清中活疫苗特异性IgG抗体水平（p＜0.05）。同时，检测了Gel 01对抗体亚型IgG1和IgG2a的影响，结果显示，末次免疫第7 d，疫苗组和Gel 01+疫苗组之间无显著性差异；在免疫后第21、35、49 d时，Gel 01能进一步提高活疫苗诱导的IgG1和IgG2a抗体水平（p＜0.05）。以上结果表明Gel 01联合疫苗黏膜免疫能激活小鼠全身体液免疫。

2.4 Gel 01联合疫苗黏膜免疫对小鼠全身细胞免疫水平的影响

2.4.1 Gel 01联合疫苗黏膜免疫对血清细胞因子的影响 检测Gel 01联合疫苗免疫后，小鼠血清和灌洗液中Th1、Th2和Th17型细胞因子含量的变化，结果见图4。疫苗组的血清中IFN-γ、IL-4和IL-17含量极显著高于对照组（p＜0.01），而Gel 01+疫苗组能进一步提升血清中IL-17的含量，但对IFN-γ和IL-4的含量无显著影响。

图2 ELISA检测小鼠免疫后BALF中IFN-γ、IL-4和IL-17水平Fig. 2 ELISA detection of IFN-γ、IL-4和IL-17 levels in mice BALF post immunization

图3 ELISA检测小鼠免疫后血清抗体水平Fig. 3 ELISA detection of antibodies in mice serum post immunization

2.4.2 Gel 01对小鼠淋巴细胞增殖的影响 于免疫后第21 d分离各免疫组的脾淋巴细胞，并用支原体全菌抗原刺激72 h测定细胞增殖情况，结果见图5。与对照组相比，单独活疫苗组的淋巴细胞未能显著增殖，而Gel 01+疫苗组能够产生对支原体抗原产生有效增殖应答，显著高于单独疫苗组和对照组（p＜0.05）。

图4 ELISA检测小鼠免疫后血清IFN-γ、IL-4和IL-17水平Fig. 4 ELISA detection of IFN-γ、IL-4 and IL-17 levels in mice serum post immunization

图5 各免疫组中猪肺炎支原体活疫苗细胞免疫刺激能力的变化Fig. 5 The cellular immune stimulation index of mice immunized with adjuvanted Mhp live vaccines

3 讨论

Gel 01作为商品化的佐剂具有稳定性好、副作用小的特性，已被报道用于多种动物疫苗的佐剂。刘扶摇等[11]研究表明Gel 01与猪乙型脑炎活疫苗协同免疫小鼠后，很好的诱发免疫小鼠的体液免疫应答，提高小鼠血清抗体水平，增强猪乙型脑炎活疫苗的免疫保护效果。Arous等[12]也证实Gel 01佐剂与猪圆环病毒灭活苗混合免疫小猪后，能显著增强小猪中抗原特异性的抗体滴度，提高疫苗的安全性与稳定性。但Gel 01佐剂配合猪支原体肺炎疫苗，并直接作用于黏膜系统，尚未有报道。我们前期实验表明Gel 01与猪肺炎支原体的兼容性较好，在浓度为20%时不影响猪肺炎支原体的活性。基于此，本研究首次考察了Gel 01作为黏膜佐剂应用于猪肺炎支原体活疫苗的免疫效果，为猪肺炎支原体活疫苗黏膜佐剂的筛选提供实验支撑。

猪肺炎支原体以呼吸道局部定植感染为主，因此宿主呼吸道的局部黏膜免疫与病原的感染保护密切相关[13]。呼吸道鼻相关淋巴组织（nasopharyngeal-associated lymphoreticular tissues，NALT）是鼻腔免疫发挥重要作用的黏膜系统[14]。NALT中的抗体分泌细胞不仅包括IgA型，也包括IgG型。其中的IgA分泌细胞主要归巢至黏膜效应部位，而IgG抗体形成细胞主要归巢至系统淋巴结，从而产生明显的气管和肺黏膜免疫反应和系统免疫[15]。李元峰等[6]研究表明猪肺炎支原体疫苗经滴鼻免疫能够增加猪鼻黏膜和气管IgA和IgG分泌细胞的面积，并促进鼻黏膜及肺组织中产生猪肺炎支原体特异性sIgA抗体[8]。本研究检测了小鼠滴鼻免疫后BALF中抗体水平，猪支原体肺炎活疫苗经滴鼻免疫后能一定程度的升高IgG1的水平，但对IgG、IgG2a以及sIgA无显著影响。一方面与猪肺炎支原体低免疫原性相关，另一方面也可能与猪肺炎支原体在小鼠呼吸道难以感染增殖而加强免疫应答相关。而Gel 01联合活疫苗免疫小鼠的BALF中抗原特性抗体（IgG、IgG1、IgG2a）的水平显著高于单独疫苗组，特别是对黏膜抗体sIgA的促进作用尤为显著。结果提示Gel 01联合猪肺炎支原体活疫苗黏膜免疫能够增强局部呼吸道体液免疫应答水平。

研究表明B细胞受抗原刺激所产生的抗体种类与CD4+T细胞所产生的细胞因子密切相关。CD4+T细胞经树突细胞提呈的MHC-外源性抗原肽复合物活化后，可分化为Th1、Th2和Th17等细胞亚型。其中Th1细胞主要分泌IFN-γ、IL-2和TNF-β等细胞因子，IFN-γ可促使B细胞分泌抗原特应性的IgG2a抗体；而Th2细胞分泌的IL-4，可促进抗体类别向IgG1和IgE转化[16]。Th17细胞分泌IL-17可促进B细胞分化为IgA分泌细胞，提高sIgA的水平[17]。因此，为了探明Gel 01对黏膜局部细胞免疫应答的影响，本研究检测了免疫后小鼠BALF中相关因子的水平。结果显示，Gel 01联合猪肺炎支原体活疫苗免疫后能显著上调BALF中Th1（IFN-γ）、Th2（IL-4）和Th17（IL-17）型细胞因子的表达，这些细胞因子水平的升高也与之前检测的抗体水平的升高相一致。以上结果表明Gel 01能够同时增强局部的细胞免疫应答和体液免疫应答，诱导较强的黏膜免疫。

研究表明，全身的细胞免疫对于猪肺炎支原体的感染保护可能也起着重要的作用[18]。本研究结果也显示 Gel 01佐剂配合猪肺炎支原体滴鼻免疫能够显著促进T淋巴细胞增殖分化，从而提高机体的细胞免疫水平。

综上所述，利用黏膜免疫佐剂 GEL01 配合猪肺炎支原体活疫苗经黏膜接种能够显著提高小鼠呼吸道局部的黏膜免疫应答水平，并可激活全身循环系统的细胞免疫反应，提示GEL01可作为猪肺炎支原体活疫苗的有效黏膜佐剂预防猪肺炎支原体感染。