羊乳制品掺假检测技术研究进展

文/张昊阳 严 林 党高平 刘永峰

（陕西师范大学食品工程与营养科学学院）

1 国内外乳制品掺假检测现状

羊乳制品因其较高的营养价值以及独特的口味越来越受到人们的追捧。与牛乳相比，羊乳的营养价值相对较高、过敏原含量较低、与人乳更接近，较适用于牛乳过敏人群[1]。

我国羊乳源主要集中在陕西、山东等地，奶山羊存栏量有限，且奶山羊泌乳期短、产量低，冬季为奶山羊干奶期，一天产量只有5 kg左右[2]。近年来，羊乳的价格高于牛乳，使得一些商家在利益驱动下将牛乳掺入羊乳中。这种现象会扰乱乳制品市场，进而制约乳制品行业的发展，因此对羊乳掺入牛乳检测技术深入研究十分必要。目前常用于定量检测牛羊乳混掺的方法都是以其中蛋白质、脂肪、DNA、维生素等为特征指标建立的[3]。

1．1 国内外乳制品掺假事件

2008年爆发的三鹿牌“婴幼儿奶粉事件”引起了社会的广泛关注，国产奶粉出现严重的信任危机，随后国家成立了全国打击违法添加非食用物质和滥用食品添加剂专项整治领导小组。19世纪牛乳掺假也曾使英国的牛乳行业臭名昭著。国外牛乳掺水现象最为普遍，经过脱脂、掺水的牛乳变得稀薄，商贩们便往牛乳中添加各种替代物，如添加面粉或淀粉以增加牛乳的黏稠度，添加胡萝卜汁以增加牛乳含脂量及甜味，甚至会掺入动物脑髓使牛乳产生泡沫。2013年，巴西的5 家奶牛场在原料牛乳中掺入大量井水，而为使蛋白质含量达到要求，再向其中掺入大量尿素。

1．2 国内外乳制品掺假法规与标准

面对乳制品行业以次充好，以假充真的作假行为，国内外乳制品安全管理部门下发了相关政策文件进行整治，对于现在乳制品的健康发展起到了积极地推动作用。

2015年，我国针对国内羊乳产业中羊奶粉掺牛乳清粉侵犯消费者知情权这一行业潜规则乱象，特别要求商家对羊奶粉进行具体标注，尤其要在配料表中标明每100 g产品中羊乳（粉）所占比例，以及乳清蛋白粉的来源。2008年10月通过的《乳制品质量安全监督管理条例》中明确规定,生鲜乳收购者、乳品企业在生鲜乳收购、乳制品生产过程中，加入非食品用化学物质或者其他可能危害人体健康的物质，依照刑法第144条的规定，构成犯罪的，依法追究刑事责任，并由发证机关吊销许可证照。2010年3月26日卫生部公布了《生乳》（GB19301—2010）等66 项新乳制品安全国家标准。

发达国家对食品安全的检测与监督体系更为成熟，1962年成立的国际食品法典委员会（Codex Alimentarius Commission，CAC），制定的《国际食品法典》（Codex）已被世界贸易组织（World Trade Organization，WTO）认可为国际农产品及食品贸易仲裁的重要参考依据，汇集了国际食品法典委员会已经批准的标准、规范、准则和其他等。Codex法典的纵向产品标准主要规定了原料要求、成分指标、可用添加剂、污染物指标、卫生、标签等。

2 羊乳掺入牛乳检测方法研究进展

目前，羊乳掺入牛乳检测主要依据牛乳、羊乳各营养成分的差异展开，包括蛋白质与氨基酸、脂肪与脂肪酸、β-胡萝卜素以及DNA分子的差异等。基于不同差异，得到了不同的检测方法，包括：基于牛羊乳中蛋白质分子构成不同的反相高效液相色谱、电泳、质谱及酶联免疫法（Enzymelinked Immune Sorbent Assay，ELISA）等；基于牛羊乳脂肪酸组成差异的色谱、色谱-质谱联用等检测方法；基于牛羊乳氨基酸及维生素差异的荧光光谱检测方法；基于牛羊乳中DNA差异的聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）等分子生物学检测方法。此外，最新的非线性化学指纹图谱技术、电子鼻等应用，也为羊乳掺入牛乳检测提供了可靠支持。

2．1 羊原料乳掺入牛乳检测方法及其特点

羊原料乳掺入牛乳检测方法主要有以下5 种。

2．1．1 普通PCR检测方法

主要利用牛特异性引物与羊特异性引物进行双重PCR检测，再用琼脂糖凝胶电泳分析，在凝胶成像分析系统观察结果[4]。

2．1．2 荧光定量PCR检测方法

主要选取牛、羊线粒体基因的特异性引物，以新鲜牛、羊乳样品提取模板DNA，建立了基于DNA结合染料的实时荧光定量PCR方法[4]。

2．1．3 免疫层析试纸法

主要以牛乳αs1-酪蛋白及牛乳β-乳球蛋白为检测对象，制备两者的特异性抗体，建立双联胶体金免疫层析试纸条，用于羊乳掺入牛乳检测[5]。

2．1．4 间接ELISA定量检测方法

主要以牛乳中β-酪蛋白作为抗原产生多克隆抗体，并对抗体加以修饰，建立适合现场快速检测的羊乳中掺入牛乳含量的ELISA方法[6]。

2．1．5 高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）法

主要利用不同种类乳中乳清蛋白的保留时间不同，定性分析乳的种类，根据峰面积进行定量检测其含量，可检出至少10%的牛乳掺入[7]。

2．2 检测方法及其特点

羊乳制品掺入牛乳检测方法主要有以下4 种。

2．2．1 离子交换色谱法

以离子交换为基础结合液相色谱快速分析不同种类乳制品中的蛋白，离子交换后的酪蛋白可以与免疫学法ELISA相结合，对乳及乳制品进行鉴定[7]。

2．2．2 基于毛细管电泳的乳蛋白掺假检测方法

利用毛细管区带电泳检测羊乳产品中掺入的牛乳成分，其中牛乳的定性和定量检测依据乳中是否存在特异性乳清蛋白，电泳检测峰具有很高的分辨率，最小检出量在乳混合物中体积分数为2%，在乳酪中体积分数为4%[8]。

2．2．3 等电点聚焦法

欧盟推荐鉴别非牛乳乳制品中含有牛乳的方法，主要用血纤维蛋白溶酶对乳及乳制品中的β-酪蛋白水解，对其水解产物γ2-酪蛋白和γ3-酪蛋白标记，并检测这两种酪蛋白的等电点值，根据等电点值大小检测不同种类的乳源成分[7]。

2．2．4 ELISA法

可以用来鉴别掺有乳源成分的羊乳及羊乳制品，如掺有牛乳的绵羊和山羊乳酪（检测限为0.1%～1%牛乳）[9]。

3 羊乳掺入牛乳检测方法比较

目前，羊乳掺入牛乳检测方法手段多样且繁杂，但主要分为两大类，即短时间（0.5～1.5 h）检测法和长时间（1.5～5.0 h）检测法。通过比较这两大类方法的检测时间、准确度和成本，对主要牛羊乳掺假检测方法进行简要归类和分析。

3．1 羊乳掺入牛乳检测方法时间比较

3．1．1 短时间牛羊乳混掺检测方法

（1） 胶体金免疫层析技术

薛海燕等[5]以牛乳αs1-酪蛋白及牛乳β-乳球蛋白作为胶体金免疫层析中所应用的抗原，制备相应多克隆抗体，利用该技术制备的试纸条进行检测，检测时间仅需5～15 min，即可通过颜色变化来判断羊乳中是否掺有牛乳。

（2）电子鼻

电子鼻方法鉴定羊乳掺假是主要的短时间检测方法，测定时间40 min以内。贾茹等[10]利用电子鼻结合化学计量法对羊乳中的蛋白质掺假进行定性和定量研究，鉴定时电子鼻在25 ℃平衡30 min，然后进行测量，检测时设定样品准备时间5 s，检测时间60 s，测量计数1 s，自动调零时间10 s，清洗时间5 min。金嫘等[11]通过电子鼻系统检测在羊乳中掺入不同比例的牛乳混合物中挥发性物质响应值，发现对于生乳和巴氏杀菌乳主成分分析（Principal Components Analysis，PCA）和线性判别分析（Linear Discriminant Analysis，LDA）均能够区分羊乳中混入的不同比例牛乳，具有较好的区分性。鉴定时样品于20 ℃平衡5 min，电子鼻测定条件为传感器清洗时间5 min，传感器归零时间10 s，样品准备时间5 s，每次分析用时1 min左右。

（3）HPLC

HPLC法鉴别牛羊乳混掺的时间也较短，为0.5～1.5 h。李宝宝等[12]建立了一种以β—胡萝卜素的含量作为特征指标，通过HPLC检测羊乳中掺入牛乳的定量分析方法，前处理皂化、离心约1 h，色谱分析约30 min，可准确的定量检测羊乳中掺入牛乳的比例。杜晞等[13]采用电泳和高效液相色谱联用检测水牛乳中掺入的普通牛乳，该方法分析了两种乳的乳清，方法需要样品少，分离效果好，易定性，分析时间短（30 min内），且聚丙烯酰胺凝胶电泳方法能检测到掺入1%的牛乳。

（4）ELISA

由于检测形式不同，ELISA法鉴别牛羊乳混掺的时间差异比较大，一般在1.5 h以内，偶有超过1.5 h。薛海燕等[6]以牛乳中β-牛酪蛋白作为抗原产生多克隆抗体，并对抗体加以修饰，建立了适合现场快速检测的羊乳中掺入牛乳含量的ELISA方法，除样品预处理需要30 min外，其余检测步骤可在10 min左右完成。依据ELISA法检测原理，德国R-Biopharm公司研发出的系列检测试剂盒及快速检测条可供生产中快速检测羊乳掺假[14]，其中原料乳检测用时90 min、乳制品（酸乳、乳酪等）检测用时150 min、快速检测条5 min，检出限分别为0.1%牛乳、0.5%牛酪蛋白及0.5%牛乳成分。

3．1．2 长时间牛羊乳混掺检测方法

（1）PCR等分子生物学技术

PCR等分子生物学技术方法检测牛羊乳混掺的时间需要3～5 h。宋宏新等[4]根据牛、羊的线粒体12S rRNA基因将靶基因设计合成两对特异性引物，建立了羊乳中掺入牛乳的双重PCR检测方法，此过程提取DNA预处理约1 h，之后采用检测试剂盒快速法用时10 min、磁珠法1.5 h，再进行PCR扩增35 min，扩增后进行琼脂糖凝胶电泳，30～60 min，EB染色30 min，灭菌双蒸水脱色10 min，最终置凝胶成像分析系统观察结果。建立基于染料的实时荧光PCR法对羊乳制品中牛乳成分进行掺假鉴别检测，该过程中脱脂样品制备1.5 h，DNA提取20 min，荧光定量PCR反应20 min，琼脂糖凝胶电泳1 h。

（2）非线性化学指纹图谱

利用非线性化学指纹图谱法检测牛羊乳混掺消耗的整体时间较长，樊成等[15]通过对牛、羊乳建立的非线性化学指纹图谱各个参数进行单因素方差分析，发现两类图谱的诱导时间和最高电位时间具有极其显著差异，此方法需要1.5～3.0 h可获得结果。鲁利利等[16]以非线性电化学指纹图谱技术鉴别羊乳和牛乳及其产地，通过指纹图谱直观特征鉴别羊乳和牛乳，图谱用时为1.5～3.0 h。薛建龙[17]通过气质联用技术建立指纹图谱对牛羊乳及其制品的脂肪酸组分进行分析测定，发现癸酸是二者差异最大的脂肪酸，整体耗时3～4 h。

3．2 羊乳掺入牛乳检测方法准确度的比较

3．2．1 短时间快速处理方法准确度分析

（1）胶体金免疫层析技术

胶体金免疫层析技术是一种较为简便、快速的技术。薛海燕等[5]以牛乳αs1-酪蛋白及牛乳β-乳球蛋白为检测对象，用于快速检测羊乳中掺入的牛乳，用试纸条检测样品结果显示，当牛乳掺入量为5%时试纸条即显色，但牛乳掺入量低于5%时不显色，故试纸条的最低检测限为5%。赵芳等[18]以牛免疫球蛋白G为检测对象，建立了检测羊乳中牛乳成分的竞争免疫层析法，可以检测出含有2%牛乳的羊乳，受基质干扰较小。

（2）电子鼻

电子鼻系统是一种新型的快速检测手段，广泛应用于现场在线检测羊乳掺假。贾茹等[10]利用电子鼻结合化学计量法对羊乳中的蛋白质掺假进行定性和定量的研究，采用PCA和LCA都能区分样品掺假，线性回归分析的决定系数为84.5%，线性判别分析的原始分类正确率达到100.0%、交叉验证正确率为98.2%，K-最邻近值分析对训练集的分类正确率达到95.1%、对验证集分类正确率为97.1%。

（3）HPLC

HPLC的应用在鉴别牛羊乳混掺方面也有较高的准确度。李宝宝等[12]利用牛乳中β-胡萝卜素含量远高于羊乳的原理，建立了一种以β-胡萝卜素含量为特征指标的HPLC检测牛羊乳混掺的定量分析方法，以β-胡萝卜素为指标的样品加标回收率为89.46%～98.19%，相对标准偏差为1.50%～2.79%，牛、羊乳中β-胡萝卜素含量范围分别为0.08～0.13 μg/g和1.9×10-3～2.2×10-3μg/g，线性相关系数为0.9958～0.9988，盲样验证的相对误差为2.20%～4.75%。

（4）ELISA

ELISA在检测牛羊乳混掺方面有着多样的形式，准确度也有所差异。薛海燕等[6]利用间接ELISA方法，以β-酪蛋白作为基础检测羊乳中掺牛乳，得到最低检出限为4%，方法变异系数＜5%，回收率在94%～105%之间。Beer等[19]利用牛乳中β-乳球蛋白和γ-酪蛋白与羊乳中含量的差异，检测出山羊和绵羊乳酪中添加有0.1%的牛乳。张世伟等[20]采用制备抗牛免疫球蛋白G多克隆抗体和高特异性单克隆抗体，构建双抗夹心ELISA方法，灵敏度为0.1 μg/mL，添加回收率在95%～105%之间，相对标准偏差小于12%。

3．2．2 长时间处理方法准确度分析

（1）PCR等分子生物学技术

基于DNA的PCR检测技术有较强特异性[21～23]，目前已有较多羊乳中掺入牛乳的PCR检测方法，且都有较高的准确性。黎颖等[24]分别对羊乳中掺入牛乳和水牛乳的检测方法进行研究，在羊乳及其制品中掺入牛乳的检测限为1%，在巴氏杀菌羊乳、高温杀菌液态乳和干酪中的检测限为5%，在酸乳中的检测限为10%。利用PCR方法对羊乳制品中牛乳成分的掺假进行鉴别检测，宋宏新等[4]可定量检出新鲜羊乳中掺入2.5%的牛乳成分，基于磁珠法提取DNA的PCR检测方法检测限达1%。Liao等[22]实现了普通PCR和定量PCR对羊奶粉中掺入牛奶粉的定性、定量检测，检测限为0.1%。

（2）非线性化学指纹图谱技术

非线性化学指纹图谱技术作为一种对样本进行整体综合分析的新方法，准确度较高。王二丹等[25]利用非线性化学指纹图谱信息回归法测定了多种混合乳标样中掺杂牛乳的含量，得到各种牛乳含量测定结果的相对标准偏差≤2.1%，回收率为97.3%～102%，方法重现性好、准确度高。鲁利利等[16]利用非线性电化学指纹图谱技术对羊乳和牛乳及其产地进行鉴别区分，结果表明，不同产地的羊乳或牛乳可利用系统相似度模式识别，用系统相似度模式鉴别乳制品产地的准确度≥91.9%，平均准确度达到94.3%；鉴别乳制品种类的准确度≥94.6%，平均准确度达到98.5%。樊成等[15]通过统计学分析方法从鲜乳的非线性化学指纹图谱的诸多参数中筛选出牛羊乳之间具有差异的4 项参数指标，其中停振时间和最大振幅具有显著差异，而诱导时间和最高电位时间则具有极显著的差异，得到的牛羊乳含量比值与最高电位时间具有很好的数学回归方程，经R2检验方程合理可靠。

3．3羊乳掺入牛乳检测方法成本的比较

在时间基本相同的情况下，电子鼻、HPLC和ELISA三种较为快速的处理检测方法的检测成本稍有区别。电子鼻作为新兴仪器设备拥有较低廉的检测价格，相较于色谱仪器，具有响应时间短、检测速度快、相对成本较低，不需前处理试剂等优点，但其应用主要集中在实验室阶段，有待解决的主要问题有设备成本高、取样浓缩装置大等。HPLC检测牛乳中残留物质具有快速、精密度高、检测限低和多联检测等优点，其进样体积小、分离快、溶剂消耗少，可节约检测样品，减少消耗成本[26]，但设备及其配置费用高昂、体积较大、移动性差，对样品检测时需要进行繁琐的预处理，因此难以应用于实际工业生产。ELISA在当前羊乳掺假检测中有着广泛的应用，属于半定量检测方法，虽然会受到免疫法特异性抗体难以制备的制约，但此方法快捷、灵敏、特异性强，不需要进行反复处理，而且成本相对较低。

4 小结

本文通过简述羊乳中掺入牛乳的鉴别方法，并从检测时间、检测精确度、检测成本3 个方面对鉴别方法进行比较。

在短时间快速检测方面，电子鼻检测系统、免疫层析试纸条以及依据ELISA制成的检测盒，由于较为低廉的成本、较快的检测速度（30～60 min），有着较高的准确度——最低检测线在4%～5%，基本适用于在生产中批量定性检测羊乳中是否掺杂有牛乳。非线性化学指纹图谱技术和高效液相色谱法、气液质谱联用等已经比较成熟的传统仪器分析方法，都需要大型仪器以及较为严苛的操作条件和繁琐的前处理，适宜少量样本实验室的分析鉴别，虽然非线性指纹图谱耗时更长，但是在掺假鉴别方面拥有更高得准确度（96%～98%），且具有分析样品产地的功能。PCR检测方法是基于DNA检测的技术，拥有高特异性、高灵敏度的特点，其在羊乳及其制品掺入牛乳的检测限能达到0.1%的掺入检测比例，但是该方法有较长的前期准备和处理时间，不适宜快速检测。上述掺假检测方法可为进一步完善乳制品安全检测技术体系和保障乳制品市场的规范性提供参考和借鉴。