间充质干细胞在宫腔粘连及其他子宫内膜损伤治疗方面的研究进展

林慧隆，沈来恩，林琪，边晓丽，吴雪清

(温州医科大学附属第一医院，温州 325000)

宫腔粘连(IUA)第一次是由德国的Fritsch在1894 年报道的，但在1948年，Asherman首次对该疾病进行命名并作详细描述，因此现在也称之为Asherman综合症(AS)[1]。其主要是由于子宫内膜基底层损伤后修复障碍而导致的宫腔部分或全部粘连闭塞，从而引起月经异常、周期性腹痛、不孕及反复流产等临床表现。从组织学角度来说，IUA就是内膜基质被纤维组织替代，腺体被不活跃的柱状上皮替代，后者对激素刺激不敏感。最终子宫内膜结构遭到破坏，导致了子宫功能失常。在起初的50～60年，对宫腔粘连的研究主要集中在其流行病学、病因学和病理学。内镜技术的发展为其诊断和治疗提供了新的手段，目前以宫腔镜下粘连分解术并辅以雌激素治疗作为标准治疗手段[2]。Myers等[3]报道了一篇案例，12位重度宫腔粘连的女性在宫腔镜粘连分解术后辅以雌激素、球囊支架、宫内节育器(IUD)综合治疗后全部恢复了月经周期，并且其中6人成功妊娠。但宫腔粘连术后总体复发率为 3.1%～23.5%，其中重度粘连高达 62.5%[4]。对于重度宫腔粘连子宫内膜大面积损伤的情况下，雌激素很难达到有效的治疗作用，因为雌激素发挥作用必须在足够残留内膜的基础之上。而干细胞工程为宫腔粘连的治疗开辟了一条新的道路，以往的研究已经证明了其能通过促进子宫内膜再生来治疗宫腔粘连[5-7]。但是大样本数据的缺乏使得无法形成标准化的干细胞治疗方案。为普及宫腔粘连的干细胞治疗，一系列的问题有待解决，比如干细胞来源问题、剂量选择、用药方式等。

一、宫腔粘连概述

子宫内膜可以分为功能层和基底层。生理情况下，功能层在卵巢周期性的激素作用下可发生增生、分化及脱落，再由基底层按周期规律性再生成新的功能层。正常女性生育期可经历400多个这样的周期，表明子宫内膜具有再生能力以及较强的容受性。而病理状态下，基底层修复功能受损时，子宫内膜完整性被破坏，导致宫腔发生形态异常及纤维粘连的形成。其形成机制可能为雌激素受体减少、子宫内膜干/祖细胞异常、细胞因子异常和血管形成障碍等几方面共同作用[8]。

二、干细胞治疗子宫内膜效果的评价指标

为了解子宫内膜修复效果，在动物实验中已经形成了一系列较为常用的检查。其中包括病理形态学结果(如子宫内膜厚度、内膜腺体数目、子宫内膜小血管数目及纤维化面积比率等)、免疫荧光检测(观察经标记的干细胞在内膜分布情况)、免疫组织化学检测(如角蛋白、波形蛋白及转化生长因子的检测等)、IUA相关基因检测以及子宫妊娠结局(如胚胎数目等)。

三、不同来源的干细胞治疗宫腔粘连

(一)骨髓间充质干细胞(BMSCs)

1.临床案例：国内外案例报道主要集中在自体骨髓间充质细胞的移植治疗上。Nagori等[5]的团队报道了一例将自体提取的干细胞移植到子宫腔治疗重症宫腔粘连的患者，他们从该患者自身骨髓细胞中分离出39×106个CD9、CD40、CD90阳性细胞移植至子宫腔，最终患者子宫内膜增厚达到胚胎移植的标准，并通过体外受精-胚胎移植(IVF-ET)成功怀孕。而Singh等[6]则直接将(103.3±20.5)×106个单核干细胞(MNCs)直接移植到6名患者子宫内膜下，而不是分离出特定表型的细胞再移植。结果显示全部6名患者子宫内膜厚度均较前增加，但未达到理想厚度，其中5名恢复了月经。Santamaria等[7]从外周血中分离出CD133阳性的骨髓来源干细胞，平均数量为124.39×106个，再通过导管自体移植到子宫螺旋动脉中。经过治疗后，16个宫腔粘连及子宫内膜萎缩患者中，15个恢复了月经，其中1名患者成功经阴道分娩足月儿，另一个则经剖宫产分娩足月儿。国内Zhao等[9]将携带骨髓来源单核细胞的胶原支架放置到子宫腔来治疗10个重度宫腔粘连患者，移植的干细胞密度为5×106/cm2，最终有5名患者成功生育。以上临床案例皆是通过宫腔内移植干细胞来进行治疗，细胞数量、用药途径存在一定的差别，但宫腔粘连等损伤情况都在一定程度上得到改善。

2.动物实验：Liu等[10]利用绿色荧光蛋白(GFP)标记BMDCs在子宫内膜物理损伤后的C57BL/6J小鼠模型上进行试验，分别通过静脉血注射和宫腔局部注射的方式给予治疗，结果发现全身用药的小鼠子宫内募集了更多的GFP阳性的细胞。该实验表明全身用药具有更好的的治疗效果，至少在保持损伤部位干细胞浓度上具有一定优势，其可能原因在于静脉较宫腔具有更有利于干细胞生长的环境。但静脉注射干细胞安全性及临床可行性仍需要进一步进行探索。此外，该实验也提示了能从提高局部干细胞的活性和浓度的方面入手提高干细胞移植的治疗效果，如Yang等[11]就发现，在体外实验中，维生素C(Vc)能促进Pluronic F-127(PF-127)凝胶包裹的BMSCs的生存及生长，并且在经物理损伤诱导产生的宫腔粘连大鼠模型中证明了BMSCs、PF-127和Vc三者联合治疗能促进子宫内膜修复，这表明Vc和PF-127能为BMSCs创造一个更有利的生存环境，提高其治疗作用。而最近Ong等[12]指出并没有证据表明BMDCs能转化为子宫内膜上皮、基质细胞或者内皮细胞，该团队利用更灵敏的检测手段来检测子宫内膜的免疫细胞的表型，他们推测之前关于BMDCs能转化为子宫内膜细胞系的报道其实是错误地识别了免疫细胞。这一发现是颠覆性的，因为人们普遍认为BMDCs能直接促进子宫内膜再生，基于此才形成了一系列针对损伤内膜的治疗方法。因此，明确这个问题非常重要，未来需要更多的关注该方面研究进展。然而，不论是临床还是动物实验都表明BMDCs对于内膜损伤具有一定的修复作用，且患者症状确实有改善。这也从侧面表明干细胞的治疗作用可能不是直接通过分化成为子宫内膜细胞，而更多的是通过分泌的细胞因子起作用。

(二)子宫内膜间充质细胞(eMSCs)

eMSCs作为一种多分化和高增殖潜能的干细胞，能够像其他干细胞一样被用于多种学科的再生医学[13]。已经有证据表明eMSCs能在体外转化为内膜上皮和基质细胞。同时，相对于健康对照组，宫腔粘连患者的内膜组织中拥有较少的干细胞[14]。目前，能够通过多种方法从月经血中获得此类干细胞，故又称经血干细胞[13，15-16]。其获取的条件具有重复性和非侵袭性等优点，是良好的间充质干细胞来源。

1.临床案例：除了BMSCs案例以外，临床上也有利用eMSCs来治疗7名重度宫腔粘连患者的报道。通过宫腔内移植1×106个表现为CD44、CD73、CD90 和 CD105阳性的细胞，最终结果显示其中的5名患者的子宫内膜增厚达7～8 mm，1名自然怀孕，2名经胚胎移植后成功怀孕[13]。

2.动物实验：为探究eMSCs在子宫内膜损伤疾病中的的治疗机制，Zhang等[17]利用电凝的方式建立子宫内膜损伤的小鼠模型，并通过静脉注射的方式进行eMSCs移植。研究结果显示接受移植的小鼠内膜组织厚度及微血管密度相对于对照组均有增加，并且其妊娠结局也有改善。此外还发现源自干细胞的条件培养基能够通过激活AKT和/或ERK通路减少H2O2诱导的内皮细胞凋亡、促进内皮细胞增殖和迁移能力并能促进新生血管形成。该团队的另一项研究则在利用95%酒精冲洗宫腔的方式建立SD大鼠子宫内膜纤维化模型，他们发现由eMSCs分泌的粒细胞集落刺激因子(G-CSF)能够通过抑制锌指蛋白GLI2(Gli2)表达来减少内膜的纤维化[18]。而在此之前，竺海燕[19]已经通过细胞体外实验发现经血干细胞条件培养基能显著促进eMSCs的增殖，并通过激活Hippo/TAZ通路、抑制转化生长因子β(TGFβ)的方式减轻纤维化程度。

(三)脂肪组织来源间充质细胞(aASCs)

尽管BMSCs是目前应用最为广泛的干细胞来源，但其创伤性的收集细胞过程反而加重了病人的痛苦，这点是不可避免的限制。而MSCs的获取具有重复性和非侵袭性等优点，是良好的BMSCs的替代品。脂肪干细胞有多种分化能力，已经应用很多领域，其易获取性、伦理争论小和较小的创伤性使之成为一个理想的干细胞来源。从脂肪提取物中分离而来的干细胞在体外能诱导分化成脂肪细胞、软骨细胞、骨细胞以及肌细胞等[20]。ASCs的分化潜能和其他间充质干细胞类似，且他们的分离的产量和培养时的增殖速率都要高于BMDCs[21]。针对ASCs的细胞表型分析发现这些细胞表达CD34、73、CD90以及CD105，不表达CD31、CD45[22]。其能分泌一些细胞因子，具有促血管生成、抑制免疫以及抗氧化的作用[23]。但ASCs是否能够有效修复损伤的子宫内膜、使之恢复正常生理状态仍具有争议。目前为止还未见有关脂肪来源干细胞治疗宫腔粘连的案例报道。

动物实验：Kilic等[24]将2×106个CD90、CD44和CD49表达阳性，而CD11b/c、CD45表达阴性的ASCs注射到三氯乙酸诱导的宫腔粘连大鼠的一侧子宫角，之后连续3次腹腔内注射，每次间隔5 d。结果显示有4%～6%的经标记的细胞在子宫组织被发现，同时还观察到新生血管增多、纤维化面积减少。但在纤维化降低方面，单纯干细胞治疗组较对照组没有统计学意义，反而单纯雌激素和干细胞结合雌激素治疗效果更加明显。国内的孔德胜[8]利用物理损伤和细菌脂多糖感染的双重损伤法建立大鼠宫腔粘连模型，通过子宫肌壁间注射和复合小肠黏膜下基质支架(SIS)的方式移植2×106大鼠ASCs。结果发现单纯ASCs注射移植无明显效果，只在后期发现内膜细胞上皮化优于模型组，并且原位注射的宫角后期只可见少量经绿色荧光标记的ASCs存活，至21 d时，只有极少量细胞存在。而SIS复合或不复合ASCs的方式不仅可以改善子宫内膜的病理状态指标，还可以提高子宫内膜容受性，胚胎数目增加。此外，SIS复合ASCs治疗效果较单纯SIS治疗组效果更佳[8]。这表明该种支架能有利于细胞的生存和生长，以此增加ASCs的治疗效果。在这之前，Hunter等[25]就探索过脂肪来源间质血管部分细胞(SVF)能否改善子宫内膜形态和容受性。SVF主要成分是脂肪干细胞。他们利用无水酒精成功诱导形成了SD大鼠薄型子宫模型，并在此基础上宫腔内注射0.5 ml含有1×106细胞的悬液，结果发现子宫容受性的形态学和功能学上并未显示有意义的改善，但降低了舒张微血管的紧张度，增加了组织流量。为检测受体组织中的GFP阳性的SVF细胞分布情况，该团队还进行了3D共焦成像，发现细胞植入不良，没有阳性细胞存在。

虽然上述造模方式、给药方式有些许差异，对实验造成了一定的影响。但从总体来看，单纯原位注射干细胞对于修复子宫内膜效果不佳，其可能原因与干细胞的在宫腔内的保留与植入能力有关。因此如何增强脂肪来源干细胞的活性及生存能力成了至关重要的问题。受上述实验的启发，笔者认为可以从增加给药次数、延长给药时间、用静脉注射替代原位注射及联合一些其他药物共同治疗等方面入手。近年，南方医科大学南方医院的鲁峰教授团队发明了一项新专利SVF-gel，即脂肪干细胞胶。其是通过物理方法有效去除脂肪组织中的油滴后，得到的富含脂肪干细胞和细胞外基质(ECM)的产物，后者主要成分是胶原蛋白，弹性蛋白和粘多糖。相对于普通脂肪组织，其保留了大部分ECM，为脂肪干细胞提供了良好的生存环境，增加其生存率。已有实验证明其在皮肤伤口愈合方面具有促进作用[26]。笔者认为其可能在未来能够应用于宫腔粘连等纤维化相关疾病的治疗。

同时，在脂肪干细胞使用的安全性方面，有团队尝试在移植前对其进行γ射线辐射处理，减少其增殖能力，但仍保留了促进子宫内膜再生的能力[27]，这一试验也从一方面说明干细胞修复机制不完全依赖于自身的增殖分化，其还能够分泌一些因子来产生作用。

(四)其他来源

除了上述几种主要来源的干细胞以外，还有报道利用羊膜间充质基质细胞[28]、人早孕蜕膜间充质干细胞[29]、脐带间充质干细胞[30]等探究干细胞对于宫腔粘连和子宫内膜损伤的治疗效果和机制。

四、小结

重度宫腔粘连的治疗与预防复发目前仍是难点，而基于干细胞治疗的再生医学为其创造了条件。来源广泛的干细胞为人们提供了多样化的选择，但同时，大样本数据的缺乏使得无法形成标准化的干细胞治疗方案，上述文献中涉及的造模方式、用药途径和用药剂量都存在一定差异，由此可能产生了不同、甚至相反的结局，以至于无法有效的进行分析比对，未来仍需进行大样本的实验。此外，单纯移植干细胞的效果并不理想，可能原因在于移植的干细胞受宫腔内环境影响无法产生定植、分泌的效果，因此如何在一段时间内维持和增强细胞的生存和分泌作用需要进行更深入的研究。更为理想的治疗方案是分离出有效的细胞因子代替干细胞对宫腔粘连及子宫内膜损伤进行治疗，但更全面的机制仍需要进一步的探索。随着研究的深入进行，基于间充质干细胞的子宫内膜修复和治疗将会更加准确、有效。