瘤胃产甲烷菌与其他微生物间的氢传递及其调控研究进展

金舒文，王佳

（浙江大学奶业科学研究所，浙江杭州 310058）

反刍动物瘤胃甲烷排放占全球甲烷排放量的13%～19%[1]，是甲烷的重要生物来源。瘤胃中甲烷的生成既降低了消化能到代谢能的转化率，造成能量的损耗和资源的浪费，又增加了大气中的温室气体，污染环境。产甲烷菌主要有3种营养类型：氢营养型、甲基营养型和乙酸营养型。氢营养型产甲烷菌通过氧化氢，还原二氧化碳生成甲烷。甲基营养型产甲烷菌利用甲基化合物如甲醇、甲胺、二甲基硫化物生成甲烷。乙酸型产甲烷菌利用乙酸生成甲烷。在反刍动物瘤胃内，82%的甲烷由第一种营养途径生成[2]。产甲烷菌利用氢气生成甲烷的同时，降低了瘤胃内的氢分压，保障了瘤胃中其他微生物发酵的顺利进行。产甲烷菌与原虫、细菌、真菌间的种间氢传递是其高效获取氢气的基础，也是调控瘤胃微生态进行甲烷减排的关键。抑杀原虫和产氢细菌、竞争性结合氢 、阻断氢生成甲烷是通过氢调控减少瘤胃甲烷生成的主要手段。瘤胃微生物互作直接影响氢调控的效果。为此，本文在综述了产甲烷菌与其他瘤胃微生物间的种间氢传递方式及基于氢调控的瘤胃降甲烷途径的基础上，探讨了瘤胃微生物整体化调控的可行性。

1 产甲烷菌与其他瘤胃微生物间的种间氢传递

1.1 原虫与产甲烷菌的选择性共生 大多数瘤胃原生动物具有氢化酶体，这是一种双层膜包裹的简单细胞器，内含氢化酶。苹果酸在氢化酶作用下脱羧产生ATP、氢气、二氧化碳和乙酸，提升厌氧情况下的供能效率[3-4]，氢化酶体可以诱发一些产甲烷菌成为原虫共生菌[5]。Valle等[6]借助激光共聚焦扫描显微镜，观测产甲烷菌特异性辅酶F20的自发性荧光，证实产甲烷菌的原虫细胞内共生与细胞外共生形式同时存在，且产甲烷菌能够整合到原虫的生物膜上。Ng等[7]基于基因组数据，利用噬菌体展示技术从产甲烷菌Methanobrevibacter ruminantium M1中鉴定出一种可以广谱黏附于瘤胃原生动物生物膜上的蛋白质（Mru_1499），为产甲烷菌与原生动物的共生模式提供了有力支持。原生动物胞内或者胞外共生的产甲烷菌被称为原生动物相关甲烷菌（Protozoan Associated Methanogens，PAM）。Belanche等[8]利用终端限制性片段长度多态性（Terminal Restriction Fragment Length Polymorp-hism，T-RFLP）分析瘤胃中的PAM，结果显示，PAM与瘤胃中游离的产甲烷菌具有不同的群落结构，说明在原虫与PAM的共生关系中，原虫对于PAM具有一定的“选择”作用；全毛目原生动物中内共生的产甲烷菌与总原生动物中内共生的产甲烷菌群落结构亦显著不同，说明不同的原虫存在不同的PAM结构，即产甲烷菌对于原虫亦存在一定的“选择”作用。这与Regensbogenova等[9]体外纯培养的Entodinium furca 、有尾头毛虫（Ophryoscolex caudatus）、具齿双毛虫（Diplodinium dentatum） 3种原生动物具有不同的PAM结果一致。Xia等[10]利用荧光原位杂交（Fluorescence In Situ Hybridization，FISH）技术，在单细胞水平探究肉牛瘤胃中内毛虫属原生动物和产甲烷菌的共生关系，发现饲喂含苜蓿干草与黑麦秸秆不同日粮的情况下，内毛虫属原生动物的PAM结构相似，说明瘤胃中原虫与产甲烷菌的共生关系的选择作用不受日粮影响，瘤胃中原虫与产甲烷菌存在共生关系已经是共识，然而不同原虫的PAM结构特异性尚不明确，瘤胃原生动物与产甲烷菌的互选机制有待进一步研究。

1.2 粘附素样蛋白增加产甲烷菌与细菌的黏附和聚拢 嗜热丙酸氧化菌（Pelotomaculum thermopropionicum strain SI）与 嗜热自养甲烷菌（Methanothermobacter thermaut-otrophicus strain ΔH）在丙酸盐底物培养基上共培养时，表现出空间上的聚拢现象，显微镜观察到胞外聚合物结构，且嗜热丙酸氧化菌细胞的鞭毛样细丝在相互作用中起作用[11]。反刍动物甲烷短杆菌M1（Methanobrevibacter ruminantium M1）与瘤胃产氢丁酸弧菌（Butyrivibrio proteoclasticus B316 ）共培养时，2种细胞聚集，6个黏附素样蛋白编码基因在反刍动物甲烷短杆菌M1中被上调[12]。瘤胃细菌与产甲烷菌之间不是以共生的形式，而是以黏附和聚拢的形式提高氢传递的效率。

1.3 产甲烷菌改变真菌代谢途径提高纤维降解效率 与单纯真菌培养物相比，瘤胃真菌-产甲烷菌共培养物表现出高纤维降解能力和高多糖水解酶酶活[13]。厌氧真菌也存在氢化酶体，产甲烷菌能通过去除厌氧真菌氢化酶体中丙酮酸分解积累的甲酸和氢，增强氢化酶体中的乙酸通路，同时减少细胞质基质中的乳酸通路，达到促进底物分解、增加能量生成的作用[14]。目前未见真菌与产甲烷菌共生的报道，瘤胃真菌和产甲烷菌间应该通过特异性的伴生关系[15-16]提高氢传递的效率。

2 基于氢调控的瘤胃降甲烷途径

2.1 抑杀原虫和产氢细菌 脂质[17]和单宁[18-19]、皂甙[20]、精油[21]等植物提取物都有抑杀原虫和降甲烷的作用，效果与其来源有关。在奶牛日粮中加入粉碎的油菜籽可在不影响采食量的情况下有效降低甲烷排放量，而葵花籽和亚麻籽的甲烷减排作用以减少采食量为代价[17]。绵羊饲粮中直接添加含有单宁的合欢叶片、百脉根或者冠状岩黄芪，瘤胃中原虫数量甚至随着单宁有效添加量的增加而线性增加[22-23]，而从各类植物中提纯得到的单宁则显著降低了原虫数量[18-19,24]，且分子缩合程度越高，抑杀原虫降甲烷效果越好。皂甙降甲烷效果的荟萃分析结果表明，提取于丝兰的皂甙降甲烷效果最佳，茶次之，皂树最弱[25]。与单宁和皂甙相比，精油的种类最为丰富，但其中大部分仍然停留在体外试验阶段，百里香油、肉桂油、柑橘油经体外证实能够在不影响生产性能的情况下减少甲烷排放量[26-27]。植物次生代谢物由于来源广泛、安全，是理想的降甲烷物质，但体内试验呈现出不一致的结果。Pathak等[28]通过无花果和番石榴叶粉，给羔羊补喂占日粮干物质1%～2%的聚合单宁，发现补喂单宁可显著提高羔羊的氮代谢、生长性能、羊毛产量、饲料转化率，并且降低甲烷排放量。但Beauchemin等[29]使用占日粮干物质1%～2%的商品单宁（白坚木提取物）饲喂安格斯牛，发现试验组牛的日增重、饲料消化率和甲烷产量均没有显著变化，只有蛋白质表观消化率显著降低。导致甲烷减排效果不一致的因素很多，包括添加剂量、动物品种、日粮等，体内外试验结果不一致亦表明瘤胃微生态的复杂性，以及微生物的调控手段需要进一步优化。有研究使用莫能菌素[30]和细菌素[31]等可改善瘤胃微生物代谢，抑杀产氢细菌，但体内试验表明莫能菌素不能抑制所有的革兰氏阳性菌群，而仅对细菌种群产生细微影响，且降甲烷效果在饲喂几周后即消失[32]。

抑杀产氢细菌难度较大且效果不佳，而原虫和产甲烷菌之间密切的共生关系使抑杀原虫成为研究热点之一。抑杀原虫的方法多样，其中植物次生代谢物表现出巨大潜力，但适宜添加剂量难以确定，实际降甲烷效果不稳定。

2.2 竞争性结合氢 硝基化合物可以在瘤胃中竞争结合氢生成氨，在体外发酵试验中降低甲烷排放量达92%，但硝酸盐和硝基化合物在代谢过程中产生的亚硝酸盐和乙胺具有毒副作用，限制了其应用[33]。卤代脂肪烃也可以作为末端电子受体竞争性结合氢起到降甲烷作用，如溴氯甲烷在体内试验中降低肉牛甲烷排放50%～60%[34]，但卤代烃的降甲烷作用存在适应性[35]。卤代脂肪烃对于大气的污染和不可忽视的生物毒性也限制了其在畜牧业上的应用。而藻类中含有有机卤化物，Machado等[36]以肉牛瘤胃液为材料，针对20种藻类进行的体外产气试验表明，底物中添加这20种藻类均能降低甲烷产量，其中网地藻属和海门东属分别降低甲烷产量达92.2%和98.9%。由于地球表面水域面积广阔，藻类生长迅速，是再生周期短且储量丰富的生物资源，因此可以作为潜在的环保型饲料来源，用于瘤胃甲烷减排。

2.3 阻断氢生成甲烷 了解甲烷生成途径的生化机理之后，可以通过调控关键途径的酶活性，阻断甲烷的生成。其中最引人注目的是3-硝基酯-1-丙醇（3-nitrooxypropanol，3-NOP）的瘤胃降甲烷作用。Hristov等[37]的体内试验表明，饲喂60 mg/kg日粮（干重）添加量的3-NOP就能降低泌乳期荷斯坦奶牛甲烷排放量30%左右，持续饲喂12周仍未出现适应性，且对瘤胃发酵水平和泌乳性能没有影响。Romero-Perez等[38]以2 g/d的添加量饲喂肉牛3-NOP，持续128 d，发现甲烷生成持续减少，没有产生适应性，停止添加3-NOP后，降甲烷作用随之消失。Duin等[39]在体内、体外试验的基础上，利用计算机分子建模模拟配体-受体对接，提出3-NOP降甲烷的原理可能是3-NOP与甲基辅酶M还原酶竞争性结合，氧化其活性部位Ni（I）后使甲基辅酶M还原酶失活。缜密而持久的体内试验证实了3-NOP的降甲烷效果，排除了对生产性能的不利影响，进一步的机理探究使人们对3-NOP的了解更为完整，为实际大规模使用提供铺垫，应用前景广阔。

3 瘤胃微生物的整体化调控

3.1 维持瘤胃微生物群落功能 瘤胃微生物群落是一个复杂的整体，反刍动物瘤胃对于粗饲料的高效分解是在细菌、真菌、古菌、原虫等微生物互相“协作”下完成。产甲烷菌与其他瘤胃微生物之间复杂的种间氢传递是瘤胃微生物互作中重要的一环，因此当使用降甲烷添加剂时，即使仅是抑制产甲烷菌或者原虫，由于破坏了原本微生物群落的平衡，往往会对瘤胃的发酵能力产生负面影响，继而影响到动物的生产性能。控制添加剂量能够减弱或者消除降甲烷添加剂对于反刍动物瘤胃发酵性能的不利影响，但甲烷抑制效果也将随之减弱，而且氢调控添加剂的作用与动物种类和饲粮等有关，造成了实际生产中操作的困难[40]。多种添加剂联用是能兼顾瘤胃微生物群落功能的解决途径之一。硝酸盐既是电子受体又能直接抑制产甲烷菌，从而起到显著的降甲烷作用[41]，然而随着日粮中硝酸盐浓度增加，荷斯坦奶牛的采食量和产奶量都呈线性下降[42]。而较低剂量的硝酸盐和抑杀原虫的皂甙（硝酸盐5 mmol/L、皂甙0.6 g/L）联用时，能够显著降低甲烷排放量，同时增加了饲料降解率和总挥发性脂肪酸含量，降低了产甲烷菌丰度[43]。皂甙虽然有明显的降甲烷作用，然而适口性差，不宜添加过多，硝酸盐和皂甙联用能缓解这一问题。Patra等[44]进一步通过体外试验评价了皂甙、硝酸盐和大蒜油这3种不同氢调控机制的添加剂在高精饲料和高粗饲料底物下的联用效果，结果表明皂甙、硝酸盐和大蒜油单独使用时，降甲烷效率受饲料底物影响较大，但联用时效果较为稳定。这一结果表明，多种氢调控机制的添加剂联用能够得到更为稳定的效果，或许能够降低生产应用中的风险，具有实际应用价值。另一种思路是对幼龄反刍动物瘤胃进行早期调控，通过影响微生物定植过程，塑造一个甲烷排放量少的瘤胃微生物群落。Abecia等[45]的双胞胎试验中，连续饲喂分娩母羊溴氯甲烷2个月及其初生羔羊3个月，能改变羔羊瘤胃产甲烷菌菌群，显著降低羔羊的瘤胃甲烷排放量，降甲烷效果持续到6月龄之后依然没有消失，而仅对羔羊或者仅对母羊饲喂溴氯甲烷则无降低甲烷排放效果。Lyons等[46]发现，早期饲喂亚麻籽油能影响羔羊瘤胃古菌和细菌定植，但Saro等[47]使用大蒜精油和亚麻籽油混合物对初生羔羊及其母羊进行调控时，发现停止饲喂后降甲烷作用消失，因此早期干预的效果或许与调控剂有关。早期干预在降低负面调控风险的同时减少投入成本，但是其降甲烷作用缺乏更长时间的观测，且尚无评估早期瘤胃降甲烷氢调控对于生产性能影响的报道，有待进一步研究。

3.2 维持瘤胃微生物群落动态平衡 诸多氢调控剂的降甲烷效果在持续的生产试验中表现出随时间衰减，即瘤胃微生物对氢调控剂存在适应性。瘤胃微生物群落作为一个有机的整体，是动态发展的，受到外界干预时将作出应答，一段时间后微生物群落又达到某个平衡状态，因此为了追求持续有效的降甲烷效果，需要避免适应性的产生。植物次生代谢物中的皂甙、单宁、精油等均表现出降甲烷作用的衰减，在适宜用于动物的低剂量时衰减效果尤甚[48]。间歇性饲喂有降低瘤胃微生物对降甲烷添加剂适应性的趋势。精油具有广谱杀菌作用，当饲喂植物精油时，早期由于精油对于原生动物和产甲烷菌的抑杀作用，甲烷产量能够出现下降，但当原虫和产甲烷菌对精油出现适应性，降甲烷作用将逐渐消失，Wu等[27]的体内试验表明，间歇性饲喂植物精油能缓解湖羊瘤胃的这种适应性，是潜在的有效降甲烷途径。而3-NOP在长期的体内试验中均未出现适应性，或许与饲喂后细菌和原虫的数量均未受到影响、微生物群落平衡未被打破有关[49-50]。只有经过长期体内试验检验的氢调控手段，才具有实际生产中推广的价值。

4 结 语

随着反刍动物甲烷减排研究，饲养试验、体外模拟瘤胃发酵、产甲烷菌纯培养等研究方法不断纯熟，但产甲烷菌与瘤胃微生物间的互作机制尚待完善，深入研究产甲烷菌与原虫、细菌、真菌间的种间氢传递，有助于发掘安全可靠、经济可行、高效持久的甲烷减排途径。降甲烷研究已经从单一向多元化、粗放到精确化发展。多种氢调控机制的添加剂联用及间歇饲喂、幼龄反刍动物瘤胃早期调控、甲烷生成途径关键酶调控将是畜牧业甲烷减排的发展方向。瘤胃不仅是甲烷减排工程的重要对象，同时也是研究微生物间互作的良好模型，蕴含着无穷的奥秘。