湖北省奶牛精料原料及牛奶中黄曲霉毒素污染调查

熊力力，吴文旋，王 羽中，熊江林*，吴灵英*

（1.武汉轻工大学农副产品蛋白质饲料资源教育部工程研究中心，湖北武汉 430023；2.武汉轻工大学动物营养与饲料科学湖北省重点实验室，湖北武汉 430023；3.贵州大学动物科学院，新农村发展研究院，贵州贵阳 550025；4.浙江农林大学动物科技学院动物营养研究所，浙江杭州 311300）

黄曲霉毒素结构相似于霉菌毒素，由黄曲霉、寄生曲霉和少量特异曲霉产生。其中，黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）毒性最强，在不当的收割和储存条件下产生进而污染奶牛饲料。奶牛摄入AFB1污染的饲料后会在奶中分泌AFB1的羟基化代谢产物黄曲霉毒素M1（Aflatoxin M1，AFM1）。据报道，日粮中AFB1转化为乳中AFM1的比率为0.56%～0.59%和1%～3%，转化率的差异受泌乳阶段影响[1]。鉴于AFB1和AFM1的肝脏毒性和致癌性，它们被国际癌症研究机构列为I类致癌物质[2-3]。中国最新的饲料标准将奶牛精料补充料和植物性饲料原料中AFB1限值分别设定为10、30 μg/kg[4]。欧盟将奶牛饲料和饲料原料中AFB1限值分别设为5、20 μg/kg[5]，美国将奶牛饲料中黄曲霉毒素总量的法定限值设为20 μg/kg[6]。中国和美国将牛奶中AFM1的限值设定为500 ng/kg[7-8]，而欧盟的限值为50 ng/kg[9]。

尽管各国制定了饲料AFB1和牛奶AFM1的限量标准，但黄曲霉毒素的致癌、致畸和致突变性使得人们一直高度关注该毒素在牛奶和饲料中的污染情况。加强奶牛精料原料AFB1和牛奶产品AFM1的监测，有利于生产安全牛奶。湖北省处于亚热带地区，气候条件适合奶牛饲料原料的AFB1生成，引起牛奶AFM1污染。因此，本研究分别检测湖北省饲料厂和奶牛场精料原料以及市售的巴氏灭菌奶和超高温灭菌（Ultra High Temperature Treated，UHT）奶中AFB1和AFM1含量并分析其污染原因，为奶牛养殖和牛奶市场提供借鉴和参考。

1 材料与方法

1.1 试验时间及地点 本研究于2016年10月—2017年3月在湖北省武汉市、黄冈市、襄阳市和十堰市进行样品采集，在武汉轻工大学动物营养与饲料科学湖北省重点实验室进行样品检测。

1.2 试验材料

1.2.1 牛奶样品 在12家商超采集某乳企2个主要品牌的UHT奶120份，另采集2家乳企生产的巴氏灭菌牛奶122份。2家乳企均为黄冈市和襄阳市企业，采用黄冈市和襄阳市奶牛场的奶源生产。样品为调研期间生产的不同批次奶样，处于保质期内。UHT奶储存在4℃条件下，巴氏灭菌奶保存在-20℃条件下，在样品保质期内进行AFM1分析。

1.2.2 精料原料 从10家奶牛场和奶牛饲料生产厂采集162份饲料原料样品。其中，玉米40份（奶牛场:奶牛饲料生产厂为25:15）、麦麸21份（奶牛场:奶牛饲料生产厂为13:8）、花生饼36份（奶牛场:奶牛饲料生产厂为24:12）、大豆粕34份（奶牛场:奶牛饲料生产厂为20:14）、芝麻饼31份（奶牛场:奶牛饲料生产厂为24:7）。样本来自不同批次，每一批次随机采集5袋饲料，每袋取样1.2 kg，即原料包装上、中、下部位各取400 g，将6 kg样品混匀后通过四分法取样，最终获得有代表性的次级样品370 g。本采样方法符合《饲料采样方法》（GB/T 14699.1-2005）要求。饲料样品在65℃下风干，储存在室温条件下，1个月内完成样品AFB1检测。

1.3 主要仪器与试剂 美国伯乐酶标仪（型号BIORAD680）；德国 eppendorf八通道移液枪（30～300 μL）；生化培养箱（型号BSP-250），上海博迅医疗生物仪器股份有限公司。饲料AFB1检测ELISA试剂盒（产品货号R1211）和牛奶AFM1检测ELISA试剂盒（产品货号R1121），来自德国拜发（R-Biopharm AG，Darmstadt，Germany）。

1.4 检测方法 参照AFB1和AFM1检测试剂盒的使用说明书进行检测，包括样品前处理、加样加酶反应、竞争性酶结合反应、显色反应、终止反应5个步骤，并用设定好波长为450 nm酶标仪读取各孔吸光度（OD450）。试剂盒中的黄曲霉毒素标准品用于建立浓度和吸光度的标准曲线，根据样品的吸光度推算样品中黄曲霉毒素浓度。AFB1检出限为1 μg/kg，回收率80%～100%，变异系数8%。AFM1检出限为5 ng/kg，回收率约95%，变异系数14%。

本试验中，每个样品进行3次平行检测，每20个样品安排1个加标样品（检测AFM1时，加标浓度为0.010 μg/kg；检测 AFB1时，加标浓度为 1 μg/kg），用以评定方法的可靠性。

1.5 统计分析 采用非参数性检验方法分析样本中黄曲霉毒素浓度差异，即借助SPSS 11.5统计软件中Mann-Whitney法进行生物统计，显著性检验水平设定为P＜0.05。使用SPSS 11.5对阳性样本黄曲霉毒素浓度的中位数进行描述性分析。AFB1、AFM1的平均浓度表示为平均值±标准误。

2 结果与分析

2.1 不同饲料原料中AFB1污染情况 由表1可见，在检测的162份样品中有28.4%被AFB1污染，阳性样本平均浓度为28.5 μg/kg。AFB1污染浓度最高的样本是玉米（368.0 μg/kg），其次是花生饼（315.3 μg/kg），分别有1个（2.5%）和3个（8.3%）样本超过国家限值（30 μg/kg）。芝麻饼AFB1阳性率最高（41.9%），小麦麸阳性率最低 （4.8%），2类样本AFB1均未高于国家限值，平均浓度分别为8.7 μg/kg和3.1 μg/kg。阳性样本AFB1浓度最低的是大豆粕，平均浓度为2.1 μg/kg，最高浓度5.9 μg/kg。花生饼中AFB1平均浓度显著高于玉米（P＜0.05）。花生饼和玉米的AFB1污染浓度显著高于小麦麸、豆粕和芝麻饼（P＜0.05）。

表1 奶牛精料中主要饲料原料AFB1污染情况

2.2 牛奶中AFM1的污染情况 由表2可知，本次调研的242份牛奶中，72.7%检测出AFM1，平均浓度98.1 ng/kg，最高浓度为346.2 ng/kg，且有32.2%超过欧盟限量标准，但无样本超过我国的限量标准。

受检的122份巴氏灭菌奶中，有115份奶含AFM1（94.3%），阳性样本平均浓度为138.9 ng/kg，且有76份奶AFM1浓度超过欧盟限量标准。受检120份UHT奶中，有61份奶检测到AFM1，阳性奶样平均浓度为21.2 ng/kg，并有2份奶AFM1浓度超过欧盟限量标准。巴氏灭菌奶AFM1浓度显著高于UHT奶（P＜0.05）。

3 讨 论

3.1 奶牛饲料原料中AFB1污染情况及控制 日粮AFB1污染可引起牛奶AFM1污染，因此需要加强对泌乳期奶牛日粮AFB1的监控。为了维持奶牛泌乳性能，精料在泌乳奶牛的日粮中占比大，高产奶牛日粮中精料比例高达50%～60%。本调研发现，奶牛精料的主要组成原料是玉米、豆粕、麸皮，部分使用了花生饼和芝麻饼。因此，对这些原料进行AFB1监测可为奶牛日粮中AFB1的控制提供重要参考。Lutfullah等[10]对谷物AFB1调查发现，玉米最易遭受AFB1污染，阳性率达40%。范或等[11]发现，北京地区玉米AFB1阳性率为50.0%，4.5%样本超过国家限值。这些研究结果与本研究相似。高秀芬等[12]和杜妮[13]报道，玉米污染比率分别为74.6%和77.0%，高于本研究的污染比率（25%）。本研究中AFB1平均浓度、最高浓度和污染区间与其他文献存在较大差异，这些差异可能与田间管理（如及时灌溉）、收获管理（如及时收获、减少破损率）和储存条件（如料仓的卫生和湿度情况）有关[14]。综上，玉米易受AFB1污染，污染后浓度较高，不同时间和地区AFB1污染程度存在差异，其作为奶牛饲料原料需要严格监控AFB1。

表2 巴氏灭菌牛奶和UHT牛奶AFM1污染情况

表3 国内谷物及蛋白质饲料中AFB1污染综述

表4 巴氏灭菌奶和UHT奶AFM1污染情况

Li等[15]报道，长三角地区花生样本80%被AFB1污染，最高浓度达32.3 μg/kg。Ding 等[16]监测了华东12省花生AFB1含量，25%样本含有AFB1，1.0%样本超过国家限量，平均浓度为2.13 μg/kg，最高达720 μg/kg。本研究中AFB1阳性率和最高浓度介于上述报道相关值之间。上述研究结果显示，花生及其产品易受AFB1污染，污染后AFB1浓度较高，奶牛饲料生产中要加强花生饼的AFB1监测。

植物性饲料原料黄曲霉毒素含量受多种因素影响，包括种植活动、气候、谷物类型和储存条件。因此，为了降低饲料中AFB1含量，必须有良好的生产管理规范，如适当的灌溉、掌握好收获时间、保持谷物的完整性、水份控制在12%以下、保持谷仓的卫生并控制好储存温度[14]。

3.2 牛奶中AFM1污染情况及控制 本次调研的242份牛奶AFM1含量均低于国家限量，这与我国消费者近年来对牛奶AFM1污染的关注、奶牛场监测和各级政府加强监管密切相关。本研究还发现，巴氏灭菌奶和UHT奶的AFM1阳性率较高，一些牛奶AFM1含量高于欧洲限量，因此，牛奶AFM1污染仍应引起重视。日粮AFB1可以在奶牛体内转化为AFM1，分泌到奶中[1]，牛奶AFM1阳性率高则反映了奶牛饲料AFB1污染比例高，故而要加强奶牛饲料AFB1的监测。研究人员相继报道了我国饲料AFB1污染情况：28.4%的精料原料（本研究）、74.6%玉米[12]、25%花生[16]、100%青贮料和100%粗料[18]被AFB1污染。因此，在饲料和牛奶生产过程中实施公共卫生操作程序、HACCP规范和ISO标准等规范流程可降低牛奶AFM1的污染，奶牛饲料生产过程使用霉菌毒素吸附剂、分解酶和分解菌来降低AFB1吸收。

本研究显示，UHT奶AFM1污染程度低于巴氏灭菌奶，这与Zheng 等[19]的研究结果一致。UHT奶占有我国40%液态奶市场，是最受我国消费者欢迎的奶产品，其质量和安全控制比巴氏灭菌奶严格。关于牛奶AFM1污染的报道见表4。本研究显示，1.7%的UHT牛奶中AFM1含量超过欧盟限量，这一比率低于2010年中国（20.3%）[19]、伊朗（17.4%）[20]、印度（64.4%）[21]、2014—2015年中国（11.9%）[22]的数据。另外，本研究显示63.6%的巴氏灭菌奶AFM1含量超过欧洲限量，这一比例高于伊朗（26.7%）[20]、印度（42.9%）[21]、2014—2015年中国（0）[22]的数据，但低于2010年中国（20.3%）[19]的数据。在本研究的文献综述中，卡塔尔牛奶AFM1污染程度最小，所有的UHT奶和巴氏灭菌奶AFM1均未超过欧盟限量[23]。本次调研的牛奶AFM1均未超过国家限量（500 ng/kg），而印度的巴氏灭菌奶和UHT奶高于该限值的比率分别为42.9%和22.2%[21]。不同国家牛奶AFM1含量的差异可能与气候、地理条件以及奶牛饲料和乳品加工过程中黄曲霉毒素的监控策略有关。

4 结 论

本研究中，28.4%奶牛精料原料含有AFB1，其中2.5%样本超过我国限量（30 μg/kg），玉米和花生最易遭受AFB1污染，需要加强对易受AFB1污染的饲料原料的监测，并积极探索有效的AFB1脱毒方法。另外，所有牛奶AFM1含量低于我国限量标准（500 ng/kg），但牛奶AFM1阳性率高达72.7%，仍需加强原料奶和奶产品的AFM1控制和监测。