牙周炎患者病原菌感染状况及RANKL/OPG变化

刘勇刚， 施立煌， 张子杨， 贾 忠

（1.浙江理工大学校医院口腔科，浙江 杭州 310018；2.杭州市大江东医院检验科，浙江 杭州 311225；3.杭州植得口腔门诊部口腔科，浙江 杭州 310003；4.杭州市第一人民医院普外科，浙江 杭州 310006）

牙周炎是一种常见的慢性口腔炎症，其特征是牙周组织受损，牙周附着被破坏，易造成根面牙骨质的病理性改变，表现为牙周袋和牙齿松动或缺失，严重影响患者的生活质量[1]。牙周炎通常因口腔病原菌感染而被引发，核因子κB受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand，RANKL）/骨保护素（osteoprotegerin，OPG）系统是骨代谢的信号通路，病原菌及炎症因子通过调节RANKL/OPG，使其比例失调，导致牙槽骨吸收[2-3]。为了探讨牙周炎患者病原菌感染状况及RANKL/OPG变化，为牙周炎的临床预防与治疗提供理论依据和针对性指导，我们对接受治疗的牙周炎患者进行了研究。

1 材料和方法

1.1 一般资料

选取2015年6月—2017年6月在浙江理工大学校医院接受口腔科治疗的130例牙周炎患者作为观察组，其中男71例、女59例，年龄（41.80±7.66）岁。纳入标准：（1）牙龈沟液培养阳性，临床表现为牙龈疼痛、红肿，探诊牙龈出血、牙周溢脓或松动，牙槽骨吸收等症状；（2）经X线检查确诊牙周炎。排除标准：（1）有牙周疾病治疗史者；（2）合并高血压、心脏病者；（3）哺乳和妊娠期妇女。另选取同期同院体检健康者50名作为对照组，其中男26例，女24例，年龄（42.71±9.05）岁。2组性别、年龄等一般资料差异无统计学意义（P＞0.05）。本研究在杭州市第一人民医院伦理委员会的许可下开展，所有研究对象知情同意。

1.2 方法

选取每位患者2颗牙，采用探针测量2组受检者的牙周探诊深度（probing depth，PD）、附着丧失（attachment loss，AL）、菌斑指数（plaque index，PLI）和龈沟出血指数（sulcus bleeding index，SBI）等指标。PD 为牙周袋底部到牙龈缘的距离，AL为探针深度减去釉牙骨质界与龈缘之间的距离。PLI采用Loe和Silness菌斑指数分度法计分，按照菌斑程度计为0、1、2、4分（无出血计1分，龈沟轻度出血计2分，牙龈发红但未见红肿计3分，牙龈溃烂计4分）。

采用滤纸条法收集龈沟液。在牙周探诊最深位点处收集龈沟液样本。收集部位隔湿，去除龈上牙石，温空气轻吹10 s，用滤纸条轻轻插入龈袋，30 s后取出滤纸条，10 s后在同一部位再次取样。重复取样3次后称重，将重量差按1 mg/μL的比例换算成体积。样本于-70 ℃冷冻保存。

取出样本，置室温摇床中解冻，4 ℃  5 000×g离心5 min，去除滤纸条。采用聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）检测龈沟液中病原菌分布的情况，首先应用微量样品基因组提取试剂盒（南京森贝伽生物科技有限公司）提取龈沟液中的DNA，-20 ℃保存，所检测菌种的 16sRNA引物由南京森贝伽生物科技有限公司提供，建立实时荧光定量PCR反应体系，对PCR扩增的熔解曲线进行测序，以同源性 ≥99%为标准判定目标菌。采用酶联免疫吸附试验试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司）测定上清液 RANKL和OPG水平，严格按照产品说明书进行操作。

1.3 观察指标

（1）比较2个组受检牙的PD、AL、PLI和SBI。（2）统计观察组患者的病原菌分布。（3）比较2个组的龈沟液RANKL、OPG及RANKL/OPG。（4）统计观察组的临床检查结果（PD、AL、PLI和SBI）与RANKL、OPG的相关性。

1.4 统计学方法

采用SPSS 19.0软件进行统计分析，计量资料以x ±s表示，2个组间比较采用t检验；计数资料以[例（%）]表示，采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床检查结果

观察组受检牙的 PD、AL、PLI和SBI显著高于对照组（P＜0.05）。见表1。

表1 观察组和对照组的PD、AL、PLI和SBI比较 （x±s）

2.2 观察组与对照组病原菌分布

观察组共检出病原菌171株，对照组共检出病原菌19株。观察组的龈卟啉单胞菌、伴放线放线菌和生痰二氧化碳嗜纤维菌的检出率较高，均超过20%，牙龈卟啉单胞菌、伴放线放线菌、生痰二氧化碳嗜纤维菌和齿蚀拟杆菌的检出率明显高于对照组（P＜0.05）。见表2。

表2 观察组与对照组病原菌分布

2.3 观察组与对照组RANKL和OPG水平的比较

观察组龈沟液中的RANKL水平高于对照组，OPG水平低于对照组，RANKL/OPG也高于对照组（P＜0.05）。见表3。

表3 观察组和对照组RANKL、OPG水平及RANKL/OPG的比较 （x±s）

2.4 临床检查结果与RANKL、OPG水平的相关性

牙周炎患者的OPG水平与PD和AL存在负相关关系（P＜0.05），RANKL水平、RANKL/OPG/与PD和AL无相关性（P＞0.05），RANKL水平、OPG水平及RANKL/OPG与PLI和SBI均无相关性（P＞0.05）。见表4。

表4 RANKL、OPG和RANKL/OPG与PD、AL、PLI、SBI的相关系数

3 讨论

牙周炎主要表现为牙龈炎症、牙周组织受损、牙槽骨吸收，牙齿根基动摇，与身体其他部位的健康密切相关[4]。牙周炎通常因口腔内病原菌感染所致，牙周病患者因牙周组织受到破坏、上皮根迁移，使其暴露于口腔，而牙根表面的菌斑及细菌等渗入牙本质中，引发牙周炎[5-6]。研究牙周炎病原菌感染状况及RANKL/OPG变化，有利于指导牙周炎的预防和治疗[7]。

本研究结果显示，牙周炎患者受检牙的PD、AL、PLI和SBI均显著高于体检健康者，结果符合患者的临床症状。牙龈卟啉单胞菌、伴放线放线菌、生痰二氧化碳嗜纤维菌等是牙周炎的主要致病菌。有研究结果表明，伴放线放线菌是局限型侵袭性牙周炎的主要病原菌，牙龈卟啉单胞菌是慢性牙周炎病变区或活动部位最主要的优势菌，其存在与牙周炎治疗后复发或病情加重密切相关，重度牙周炎患者龈下菌斑的福赛坦氏菌检出率较高[8-10]，与本研究结果基本一致。患者感染病原菌的原因可能是口腔卫生条件较差、刷牙习惯不健康、吸烟、合并其他基础性疾病等[11]。

RANKL和OPG是牙周炎牙槽骨吸收的重要调节因子，其比值可以作为评价牙槽骨吸收程度的指标[12-13]。正常状态下，RANKL的表达弱于OPG，破骨细胞生成较少，牙周内环境相对稳定，而牙周炎患者的成骨细胞内RANKL的表达明显增高，牙周局部微环境RANKL和OPG的平衡失调，破骨活动活跃，促进破骨细胞形成引起的骨质吸收，牙槽骨发生过量吸收，影响其骨密度和骨强度[14-15]。本研究结果也显示，牙周炎患者龈沟液中RANKL水平显著高于体检健康者，OPG水平明显低于体检健康者，RANKL/OPG高于体检健康者。

此外，本研究结果还显示，OPG水平与PD和AL存在负相关关系，RANKL、OPG及RANKL/OPG与患者的PLI和SBI之间无相关关系，说明患病程度与牙槽骨的吸收没有必然的因果关系，纠正RANKL和OPG之间的失衡，可能为慢性牙周炎的治疗提供新的思路。

综上所述，牙龈卟啉单胞菌、伴放线放线菌、生痰二氧化碳嗜纤维菌等病原菌是牙周炎的主要致病菌，RANKL和OPG在牙周炎患者牙槽骨组织被破坏的过程中发挥作用。