溶血对液相色谱串联质谱检测血浆中儿茶酚胺及其代谢产物的影响

袁凤喜， 薛雄燕， 陈彩凤， 赖月红， 梁泳仪，李 岩， 谢雯春， 杨绍杰， 吴燕杰

（1.顺德中科优联医学检验所，广东 佛山 528000；2.佛山市第一人民医院检验科，广东 佛山 528000；3.中国科学院生物物理研究所，北京 100101）

嗜铬细胞瘤和副神经节瘤（pheochromocytoma and paraganglioma，PPGL）是分别起源于肾上腺髓质的嗜铬细胞和肾上腺外交感神经节细胞的肿瘤，嗜铬细胞瘤占80%～85%，副神经节瘤占15%～20%，二者合称为PPGL。PPGL会分泌大量的儿茶酚胺，包括肾上腺素（epinephrine，E）、去甲肾上腺素（norepinephrine，NE）和多巴胺（dopamine，DA），造成患者的血压阵发性或持续性升高。虽然PPGL患者只占普通高血压患者的0.2%～0.6%，但这些患者如未能及时得到针对性治疗，长期的高血压可对患者的心、脑、肾等器官造成严重损伤，有些患者甚至会发生高血压危象，危及生命。若PPGL患者能在早期得到准确、及时的诊断，通过手术切除肿瘤，高血压可被治愈[1]。传统的PPGL实验室检查是检测血或尿中的E和NE水平。有研究结果显示，E和NE的代谢产物变肾上腺素（metanephrine，MN）及去甲变肾上腺素（normetanephrine，NMN）主要在肾上腺髓质和PPGL瘤体内持续代谢产生，可以成为更好的PPGL检测标志物[2-3]。2016年，中华医学会内分泌分会发布的《嗜铬细胞瘤和副神经节瘤诊断治疗的专家共识》首推以血浆中游离的或尿中的MN、NMN水平来诊断PPGL，检测血或尿中的E和NE水平也可对PPGL的诊断起辅助作用[4]。对于个别只分泌DA的PPGL可以检测血浆或尿中的DA及其代谢产物3-甲氧基酪胺（3-methoxytyramine，3-MT）水平[5]。目前，临床实验室用于检测MN和NMN水平的方法有酶联免疫法、液相色谱串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LCMS/MS）、液相色谱电化学法，其中酶联免疫法的敏感性相对较低[1，6]。《嗜铬细胞瘤和副神经节瘤诊断治疗的专家共识》也建议使用LCMS/MS或电化学法测定MN和NMN水平。电化学法易存在对目标峰的干扰，LC-MS/MS敏感性高、特异性好，因此越来越多地被用于小分子代谢产物的检测。测定尿中的儿茶酚胺及其代谢产物时需要收集患者24 h尿，耗时长，患者不易配合，而收集血浆样本的可操作性相对较强。因此，检测血浆儿茶酚胺及其代谢产物的水平用于诊断PPGL会更简便。溶血是血液样本采集中最常遇到的问题，溶血样本由于响应低、有基质效应等问题经常会影响LC-MS/MS的测定结果[7]。《中华人民共和国药典：2015版》、欧洲药品管理局、美国食品与药品监督管理局都要求关注溶血样本的基质效应[8-10]。为此，本研究拟探讨溶血对LC-MS/MS测定儿茶酚胺及其代谢产物的影响，为临床取样提供参考。

1 材料和方法

1.1 样本制备

1.1.1 溶血样本制备 取肝素锂抗凝血以4 470×g离心5 min，收集红细胞，将红细胞置于-80 ℃冰箱4 h后室温融化，再以4 470×g离心10 min，取上清液，采用BC-5390CRP全自动血液细胞分析仪（深圳迈瑞公司）测定血红蛋白（hemoglobin，Hb）水平，根据Hb水平用生理盐水配成Hb分别为75.0、30.0、15.0和7.5 g/L的溶血液。分别取上述不同Hb水平的100 μL溶血液与无肉眼可见黄疸、脂浊或溶血的900 μL正常血浆混合，制备成溶血样本。根据Hb水平将样本的溶血程度分为：重度溶血（7.50 g/L）、中度溶血（3.00、1.50 g/L）和轻度溶血（0.75 g/L）；另取100 μL生理盐水加入900 μL正常血浆中，作为无溶血的正常样本。

1.1.2 含不同水平儿茶酚胺及其代谢产物的样本制备 在一定体积的溶血样本和正常样本中分别加入3-MT、MN、NMN、DA、E、NE标准品混合溶液，制成低值和高值样本。儿茶酚胺及其代谢产物加入血浆后的理论水平见表1。

表1 儿茶酚胺及其代谢产物加入血浆后的理论水平（pg/mL）

1.2 仪器与试剂

BC-5390CRP全自动血液细胞分析仪（深圳迈瑞公司）、TSQ Endura串联质谱仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）、UltiMate3000高效液相色谱仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）。甲醇（LC-MS级）、乙腈（LC-MS级）购自美国Thermo Fisher Scientific公司，甲酸（LC-MS级）、异丙醇（分析纯）、乙酸铵（LC-MS级）、甲酸铵（LC-MS级）及E、NE、DA、MN、NMN、3-MT标准品购自西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司，氘代内标E-d6、NE-d6、DA-d4、MN-d3、NMN-d3、3-MT-d4购自美国剑桥同位素实验室。

1.3 方法

1.3.1 样本前处理 （1）血浆样本：取50 mmol/L醋酸铵250 μL、内标溶液（MN-d3、NMN-d3、3-MT-d4均为2 ng/mL，E-d6、NE-d6、DA-d4均为5 ng/mL）100 μL及高、低值样本各200 μL，充分混匀后待用；（2）标准品溶液：取50 mmol/L醋酸铵250 μL、内标溶液（MN-d3、NMN-d3、3-MT-d4均为2 ng/mL，E-d6、NE-d6、DA-d4均为5 ng/mL）100 μL、儿茶酚胺（E、NE、DA均分别为156、312、625、1 250、2 500 pg/mL）或其代谢产物（MN、NMN、3-MT均分别为50、100、200、500、800 pg/mL）的标准品溶液200 μL，混匀待用。将Oasis弱阳离子交换96孔固相提取板（美国Waters公司）分别用200 μL甲醇和水进行预处理，将上述血浆或标准品样本加入经预处理的各孔中，待样本加载完成后，分别用20 mmol/L醋酸铵200 μL及乙腈与异丙醇的混合液（V∶V=50∶50）清洗样本孔，最后用2份50 μL 85%乙腈水溶液（含2%甲酸）将目标化合物洗脱至接收板中。取10 μL洗脱液，采用LC-MS/MS检测。每份样本均重复3次前处理实验。

1.3.2 色谱和质谱条件 （1）液相色谱条件：色谱柱为Xbridge BEH Amide色谱柱（2.5 μm，2.1 mm×100 mm，美国Waters 公司），柱温为35 ℃，流动相A为100%含30 mmol/L甲酸铵、pH值3.0的水，流动相B为85%乙腈及15%含30 mmol/L甲酸铵、pH值3.0的水，流速为0.4 mL/min，梯度洗脱。（2）质谱条件：电喷雾离子源，正离子扫描，离子源喷雾电压为3 600 V，离子传输管温度为350 ℃，雾化温度为330 ℃。

1.4 统计学方法

采用SPSS 17.0软件进行统计分析。呈正态分布的计量数据以x±s表示，组间比较采用配对t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 标准曲线的建立

计算儿茶酚胺及其代谢产物标准品出峰面积与内标出峰面积的比值，将其与标准品溶液浓度作线性回归。回归方程见表1。通过标准曲线计算出溶血血浆以及正常血浆中3-MT、MN、NMN、DA、E、NE的水平。

表1 儿茶酚胺及其代谢产物标准曲线的回归方程

2.2 不同溶血程度对高、低值3-MT、MN、NMN、DA、E、NE的影响

无论MN、NMN、3-MT是高值还是低值，除3-MT在Hb为7.50 g/L（重度溶血）时未能被检测到外，其他不同溶血程度的样本与正常样本之间MN、NMN、3-MT的检测结果差异均无统计学意义（P＞0.05）。高值3-MT、MN、NMN 3次检测结果的变异系数（coefficient of variation，CV）均＜15%。低值3-MT在中度溶血（Hb为1.50 g/L）时、低值NMN在重度溶血（Hb为7.50 g/L）时3次检测结果的CV均 ＞15%，不符合《生物样品定量分析方法验证指导原则》[8]对精密度的要求。见表2～表5。

当DA、E、NE为低值时，轻度溶血（Hb为0.75 g/L）和Hb为1.50 g/L的中度溶血样本的检测结果与正常样本比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。当DA、E、NE为高值时，轻度溶血样本（Hb为0.75 g/L）和Hb为1.50 g/L的中度溶血样本的DA、NE检测结果与正常样本比较差异均无统计学意义（P＞0.05），而E的检测结果在Hb为1.50 g/L的中度溶血样本中明显降低（P＜0.05）。对于Hb为3.00 g/L的中度溶血样本，无论DA、E、NE是高值还是低值均无法检出。高、低值DA、E、NE在Hb≤1.50 g/L时3次检测结果的CV均＜15%。见表2～表5。

表2 不同溶血程度样本低值3-MT、MN、NMN、DA、E、NE的检测结果 （x±s）

表3 不同溶血程度样本低值3-MT、MN、NMN、DA、E、NE 3次检测结果的CV （%）

表4 不同溶血程度样本高值3-MT、MN、NMN、DA、E、NE的检测结果 （x±s）

表5 不同溶血程度样本高值3-MT、MN、NMN、DA、E、NE 3次检测结果的CV （%）

3 讨论

溶血样本是临床实验室日常工作中最易遇到的问题样本。造成样本溶血的原因有很多：抽血时操作不当、对样本的剧烈振荡、突然冷冻等。溶血造成检测结果异常的原因主要有：（1）血细胞破裂后，细胞内的成分如钾、磷、酶类等进入血清或血浆，直接造成检测结果异常；（2）Hb会对采用比色法的部分检测项目存在干扰；（3）红细胞释放的过氧化物酶、腺苷酸激酶等对一些检测项目存在干扰。本研究结果表明溶血对LC-MS/MS检测儿茶酚胺及其代谢产物的最大影响在于待测物的质谱信号被强烈抑制，这可能有2个原因：（1）Hb对待测物有一定的吸附作用；（2）尽管对样本进行前处理可去除血浆中的大分子，但在中度溶血和重度溶血的样本中，Hb水平过高，可能已超出固相萃取板的处理能力，因此样本中仍有大量Hb未被除去，进入质谱仪后，干扰了待测物的信号。另外，溶血对儿茶酚胺代谢产物的影响要远远小于对儿茶酚胺的影响，这可能与儿茶酚胺代谢产物比较稳定，质谱信号相对较强有关。总之，中度和重度溶血会对LC-MS/MS检测儿茶酚胺及其代谢产物产生明显影响。

有研究结果显示，通过优化检测方法、增强抗干扰能力、提升检测敏感性，可消除溶血对LC-MS/MS检测结果的影响。（1）溶血样本中有干扰峰，可优化色谱条件，如流动相、色谱柱、洗脱梯度等，使待测物与基质分离[11]；HUGHES等[7]在检测血浆中的阿托伐他汀时，通过优化流动相中有机相和水相的比例，消除溶血样本中的干扰峰对内标物的影响。（2）溶血样本中待测物信号受到抑制，一方面可优化样本前处理过程，尽可能去除溶血产生的杂质，HUGHES等[7]通过在固相萃取处理前先进行蛋白沉淀，并在固相萃取处理时多进行一步酸洗，成功消除了溶血对卡维地洛定量分析的影响；另一方面也可优化离子源种类和质谱参数，提高敏感性；一般情况下，LC-MS/MS常用的离子源克服基质效应的能力依次为大气压光喷雾电离源、大气压化学电离源、电喷雾电离源[12]；（3）溶血样本和非溶血样本间的差异较大，可选用合适的内标。与结构类似物作为内标相比，同位素标记的内标可更加准确地修正基质效应对结果的影响，因此应尽可能使用稳定同位素标记的内标以消除基质效应的影响[7-8，13]。

综上所述，由于肉眼不易判断出溶血的程度，且样本溶血程度的判断标准尚未统一[14]，为了保证儿茶酚胺及其代谢产物检测结果的准确性，在日常检测的样本采集过程中应尽量避免溶血，优化检测方法可消除溶血对检测结果的影响。