微量稀释法检测男性不育患者脲原体的耐药性分析

周运恒， 石晓星， 杨 阳， 顾伟鸣， 马红霞

（1. 武警上海市总队医院检验科，上海 201103；2. 上海市皮肤病医院，上海 200443；3. 上海市东方医院健康医学管理部，上海 200120）

脲原体为条件致病病原体，可黏附于泌尿生殖道的黏膜及上皮细胞，是引起泌尿生殖道感染和男性不育的主要病原体[1]。脲原体属在健康生育人群中也有一定的检出率，但作为评价精液质量的一个重要指标，有很多医疗机构尚未开展此项检测，临床上还未足够重视[2]。多数患者感染症状轻微或无症状，常常反复发作，同时，不规范的治疗和盲目用药，导致耐药菌株不断增加。

在耐药性检测方面，我国绝大多数临床实验室使用的商品化试剂盒只能将药物敏感性试验结果定性为敏感、中介和耐药3种情况，目前尚无药物敏感性试验质控品和统一的判定标准，同一患者样本采用不同试剂检测结果差异较大。微量肉汤培养法是检测脲原体药物敏感性的“金标准”，但国内外只有少数医疗机构开展，其耐药折点多参照美国临床实验室标准化协会（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）关于革兰阳性菌的折点，或借助标准敏感株最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）判断[3-5]，一直以来没有一个公认的、标准的参考方法。目前尚未发现男性不育患者脲原体的定量药物敏感性试验的报道。定量药物敏感性试验需要先分离、纯化菌株，因鉴定、纯化、传代条件要求较高，脲原体属抵抗力差，在液体培养基中生长迅速、容易死亡，一定程度上限制了药物敏感性试验的研究和临床应用[6]。2011年，来自美国、法国和加拿大3个国家的10个参比实验室，规范了CLSI微量稀释法和琼脂稀释法的操作指南和耐药折点，但其质控标准还有待其他国家和地区的进一步验证[7-8]。

1 材料和方法

1.1 样本收集

采集2013年武警上海市总队医院就诊的男性不育患者精液样本，接种于固体选择性培养基和液体培养基（河北众爱生生物有限公司），在37°C孵箱内培养48～72 h。通过液体培养基和固体培养基联合判断。在显微镜下观察，以典型的脲原体属菌落（“海胆型”等）作为阳性的确诊标准，形态学检查可疑时可以延长培养至72 h再观察。

1.2 脲原体属菌株的分离、纯化、鉴定和冻存

排除脲原体属合并人型支原体、真菌和淋球菌混合感染样本，收集单纯脲原体属阳性的样本。在显微镜下挑选固体培养基上的单个脲原体属菌落，标记后用无菌小刀切取该处琼脂块，移入液体培养基中37°C孵育18～24 h或24～48 h，待颜色变为淡粉色或桃红色时，用液体培养基稀释10-3和10-4，取0.1 mL接种于固体琼脂，使其成单个菌落生长，再将单个菌落切下，置于液体培养基内令其生长。如此反复纯化2～3次，即得到支原体纯种，分装并保存于-80°C冰箱。

1.3 微量稀释法测定脲原体属菌株的耐药性

1.3.1 药物配置 按照CLSI M43-A指南配置药物浓度，初浓度为1 024 μg/mL。选取3类共12种抗菌药物，分别是四环素类：四环素、米诺环素、多西环素；喹诺酮类：环丙沙星、莫西沙星、左氧氟沙星、安妥沙星；大环内酯类：红霉素、罗红霉素、交沙霉素、克拉霉素、阿奇霉素，所有药物由中国药品生物制品检定所提供。用乙醇或水以及相应的稀释剂稀释药物，终浓度分别为：64、32、16、8、4、5、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03和0.015 μg/mL。采用试管法倍比稀释药物，然后按照终浓度加至96孔微量板，每孔20 μL，置于生物安全柜内过夜干燥，次日采用紫外灯消毒后放置于冰箱备用。

1.3.2 菌落计数 从菌株库中随机选取64株分离自男性不育患者精液样本的脲原体属菌株，测定菌株浓度。取1份菌株解冻，将培养液每管0.9 mL分装，加入对应的阳性菌液0.1 mL，混匀后吸取0.l mL至第2管，依此顺序作10倍递增稀释4次，得到10-1、10-2、10-3和10-44个浓度的菌液，各取20 μL置于固体培养基，37℃孵育24～48 h，在显微镜下进行菌落计数。

1.3.3 MIC测定 用10B肉汤液体培养基稀释至104～105菌落形成单位（colony-forming unit，CFU）/mL，按药物浓度梯度在96孔聚苯乙烯微量板第1～12孔逐孔加入待测菌液200 μg/mL。并设溶剂对照、培养基阴性对照、抗菌药物阴性对照和生长阳性对照。同一菌株重复检测2次，取平均值。解脲脲原体标准菌株（ATCC 33175）（河北众爱生公司）也按上述方法加样作为质控参照，每孔滴入1滴石蜡油，并加盖密封，一定湿度下置37°C培养16～24 h后观察结果。分别测定各菌株对12种抗菌药物的MIC，即当阳性对照孔的颜色首先发生改变时，能抑制支原体生长（出现颜色改变）的MIC。按照2011年CLSI M43-A文件[7]统计各种抗菌药物的MIC范围、MIC50和MIC90。CLSI规定的4种抗菌药物。耐药折点见表1。

表1 CLSI规定的4种抗菌药物的耐药折点

罗红霉素、克拉霉素、交沙霉素等其他抗菌药物的耐药折点为[9-12]：米诺环素S≤1，R≥4；克拉霉素S≤1，R≥4；罗红霉素S≤1，R≥4；交沙霉素S≤2，R≥8；环丙沙星S≤1，R≥2；安妥沙星S≤2，R≥8。

2 结果

2.1 质控结果

阴性对照、抗菌药物对照和阳性对照结果均无异常，解脲脲原体质控菌株（ATCC 33175）MIC均在要求的范围内，说明改良的微量肉汤稀释法检测脲原体属的MIC有效。见表2。

表2 脲原体质控菌株（ATCC 33175）测定结果和标准要求 （μg/mL）

2.2 药物敏感性试验结果

脲原体属对3类12种抗菌药物的MIC范围分布均较为广泛，其中红霉素、阿奇霉素为0.03～16 μg/mL，罗红霉素为0.06～16 μg/mL，克拉霉素、交沙霉素为0.015～8 μg/mL；左氧氟沙星和环丙沙星为0.5～64 μg/mL，莫西沙星为0.06～16 μg/mL，安妥沙星为1～64 μg/mL；四环素为0.015～4 μg/mL，多西环素为0.015～2 μg/mL，米诺环素为0.015～8 μg/mL。见表3。

表3 64株脲原体属菌株对12种抗菌药物的MIC （μg/mL）

在12种抗菌药物中，脲原体属对环丙沙星的MIC50和MIC90最高，分别为16.00和64.00 μg/mL，对多西环素的MIC50和MIC90最低，分别为0.125和0.50 μg/mL。在喹诺酮类抗菌药物中，MIC50和MIC90最低的是莫西沙星，分别为1.00和4.00 μg/mL；在大环内酯类抗菌药物中，MIC50和MIC90最低的是克拉霉素和交沙霉素，均为0.25和1.00 μg/mL；在四环素类抗菌药物中，对四环素和米诺环素的MIC50和MIC90均分别为0.50和1.00 μg/mL。耐药率最高的前3种抗菌药物分别为环丙沙星（92.2%）、左氧氟沙星（70.3%）、安妥沙星（64.0%）；耐药率最低的3种药物分别为阿奇霉素（0.0%）、交沙霉素（1.6%）和多西环素（3.1%）。见表4。

表4 64株脲原体菌株药物敏感性试验结果

按照CLSI M43-A文件已经有的折点判断，脲原体属对红霉素、阿奇霉素、左氧氟沙星、莫西沙星、四环素和多西环素的耐药率分别为9.4%、0%、70.3%、20.3%、9.4%和3.1%。根据文献[9-12]报道的折点判断，脲原体属对罗红霉素、克拉霉素、交沙霉素、环丙沙星、安妥沙星和米诺环素的耐药率分别为37.5%、6.3%、1.6%、92.2%、64.0%和6.3%。

3 讨论

支原体由于无细胞壁结构，对青霉素及头孢菌素天然耐药，而对干扰蛋白质合成及DNA复制的药物敏感。临床上用于脲原体属感染治疗的抗菌药物主要有四环素类、大环内酯类和喹诺酮类3类。结合临床实际，我们选择了12种常用抗菌药物来检测脲原体的耐药性。在进行药物敏感性试验的过程中，我们参照文献对传统微量肉汤培养法作了一些改进，采用试管法，先将抗菌药物倍比稀释后再加样至96孔微量板，过夜干燥，紫外灯消毒后放置冰箱备用，与微量板孔内稀释相比，可以减少操作难度，增加抗菌药物浓度稀释的准确性，从质控菌株MIC分布结果看，改良的MIC微量肉汤稀释法结果稳定。

本研究结果显示男性不育患者脲原体属对12种抗菌药物的MIC范围分布均较广，脲原体属对环丙沙星的MIC50和MIC90最高，耐药率为92.2%，对多西环素的MIC50和MIC90最低，耐药率为3.1%。在喹诺酮类抗菌药物中，MIC最低的是莫西沙星，耐药率为20.3%；在大环内酯类中，MIC最低的是克拉霉素和交沙霉素，耐药率分别为6.3%和1.6%；在四环素类抗菌药物中，对四环素和米诺环素耐药率分别为9.4%和6.3%。耐药率最高的前3种抗菌药物分别为环丙沙星（92.2%）、左氧氟沙星（70.3%）、安妥沙星（64.0%）；耐药率最低的3种药物分别为阿奇霉素（0%）、交沙霉素（1.6%）和多西环素（3.1%）。

近年来，国内外关于脲原体属的定量药物敏感性试验的结果差异较大。KRAUSSE等[4]于2010年报道了过去20年分离的179株脲原体属对四环素的MIC50和MIC90分别为1和2 μg/mL，耐药率为3%；对环丙沙星的MIC50和MIC90分别为2和4 μg/mL，耐药率为16.2%，对多西环素、克拉霉素和交沙霉素的耐药率均＜5%。LU等[13]2010年发现脲原体对红霉素、克拉霉素、阿奇霉素和克林霉素的MIC90均为128 μg/mL，只有28%（MIC≤8 μg/mL）的菌株对这4种抗菌药物全部敏感。刘杨等[5]2007年报道克拉霉素体外抗菌活性最大，MIC50和MIC90分别为0.125和0.25 μg/mL。FERNÁNDEZ等[14]发现脲原体对左氧氟沙星的耐药率在6%左右，脲原体属的2个生物学分群UPA群和UUR群对环丙沙星的耐药率分别为27.2%和68.8%（MIC≥4 μg/mL）。本研究中脲原体对于喹诺酮类的耐药率明显高于其他报道，这些差异可能是由于耐药折点、不同生物群、人群地区分布、用药习惯、生物膜等耐药机制的差异导致的[15-16]。

本研究发现对脲原体属耐药率最高的是喹诺酮类，阿奇霉素、交沙霉素和多西环素可作为男性不育患者治疗脲原体属感染的首选药物。目前CLSI对脲原体仅有5种抗菌药物的折点，其他药物的折点还需进一步完善；另外MIC检测的影响因素较多，增菌肉汤成分、菌落计数、结果颜色判断等操作还缺乏统一的标准。因此，研究精液样本脲原体耐药性检测的标准化方案，为不同实验室之间检验结果的互认提供重要依据，对反复感染和耐药性较高的疑难菌株进行个体化治疗和精准医疗更有临床指导意义。