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2012—2016年上海地区AIDS患者分枝杆菌分离及耐药情况分析

2019-01-10蔡金凤张桂红郑江花

检验医学 2018年12期
关键词:上海地区胶体金敏感性

蔡金凤, 张桂红, 郑江花

(1. 上海市公共卫生临床中心医学检验科,上海 201508;2. 上海健康医学院附属周浦医院检验科,上海 201318)

获得性免疫缺陷综合征(acquired immune deficiency syndrome,AIDS)是由人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)感染引起的慢性传染病,主要通过血液和性行为传播。HIV攻击人体免疫细胞,引起机体免疫力下降,从而继发各种机会性感染,是AIDS患者主要死因之一[1-2]。近年来,HIV感染合并结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)感染已成为公共卫生系统的重大问题。分离自AIDS患者的大量非结核分枝杆菌(nontuberculous Mycobacterium,NTM)[3],进一步提示为AIDS患者合并分枝杆菌感染的防治提供新策略已经迫在眉睫。上海市公共卫生临床中心为上海地区AIDS患者唯一定点收治医院,为了解本地区AIDS患者分枝杆菌感染状况及药物敏感情况,本研究对上海市公共卫生临床中心2012—2016年收治的所有AIDS患者分枝杆菌分离及耐药情况进行分析。

1 材料和方法

1.1 样本来源

收集2012年7月—2016年12月上海市公共卫生临床中心收治的1 940例AIDS住院患者所有送检分枝杆菌培养的临床样本,包括痰液、灌洗液、尿液、粪便、穿刺液、胸水、腹水、分泌物、引流液、支刷物、全血和脑脊液等。同一患者相同样本类型的同一分离菌株不重复计算。

1.2 仪器与试剂

美国BD公司BACTEC MGIT 960全自动分枝杆菌检测系统和SIRE系列试剂盒、BACTEC9120血液培养系统及配套培养瓶;美国Sigma-Aldrich公司生产的改良中性罗氏培养基;杭州创新生物检控技术有限公司生产的凯必利MTB抗原检测试剂盒(胶体金法)。所有AIDS患者均经过酶联免疫吸附试验和免疫印迹法(western blot,WB)确诊HIV抗体阳性。

1.3 方法

1.3.1 分枝杆菌分离培养 非血液样本采用BACTEC MGIT 960全自动分枝杆菌液体培养技术、血液样本接种于含溶血素分枝杆菌/真菌瓶,采用BACTEC9120血液培养系统进行分枝杆菌培养。

1.3.2 分枝杆菌菌型鉴定 采用MTB抗原检测试剂盒(胶体金法)对分枝杆菌进行菌型鉴定,区分MTB和NTM。

(1)固体培养基培养物处理方法。用培养抗酸菌的固体培养基(如改良罗氏培养基)37°C培养2~4周,直至培养基上能确认菌落生长为止。步骤为:在试管中加入0.2 mL生理盐水,从培养基上生长的菌落中采集菌体1 μL,将采集的菌体悬混在试管内的缓冲液中,试管加盖后用涡旋混合器充分搅拌,将悬浊的菌液作为样本待测。

(2)液体培养基培养物处理方法。用培养抗酸菌的液体培养基37°C培养1~2周,直至能确认菌落生长、培养液浑浊为止。搅拌培养容器内的培养液,将其作为样本待测。

(3)分枝杆菌菌型鉴定。将100 μL样本滴到检测板,15 min后观察,判定方法为:检测线(T)及质控线(C)均出现紫红色条带判定为MTB,仅质控线(C)出现紫红色条带判定为NTM。

1.3.3 分枝杆菌药物敏感性分析 采用《中国结核病防治规划实施工作指南(2008)》[4]推荐的比例法进行药物敏感性试验,以改良中性罗氏培养基作为基础培养基,按照《结核菌检验细菌学检验规程》[5]的要求进行操作。采用BACTEC MGIT 960全自动分枝杆菌检测系统检测分枝杆菌对一线抗结核药物的敏感性,严格按照试剂盒说明书进行操作。

2 结果

2.1 分枝杆菌分离情况

2012—2016年共送检1 940例AIDS住院患者的分枝杆菌培养样本4 648例,人均送检样本2.4例,其中分枝杆菌阳性样本892例(19.19%);1 940例AIDS患者中分枝杆菌感染者420例(21.65%)。分枝杆菌年度分布见表1。

2.2 不同类型样本分枝杆菌分离情况

送检样本中以痰液及脑脊液样本居多,二者的分枝杆菌分离率分别为20.08%和6.98%;而全血样本5年内仅送检了37例,有31例分离出分枝杆菌。

2.3 MTB和NTM样本分布情况

通过MTB抗原检测试剂盒(胶体金法)对阳性样本中的分枝杆菌进行菌型鉴定,共鉴定出409株不重复菌株,其中MTB 199株(48.66%)、NTM 210株(51.34%)。MTB和NTM样本来源均以痰液为主,分别占58.29%和71.43%;MTB样本来源居第2位的为脑脊液,共19例(9.55%);而以脑脊液为样本来源的NTM则仅有3例(1.43%)。NTM除分离自痰液外,主要分离自全血和粪便样本,分别为16例(7.62%)和15例(7.14%)。见表3。

表1 2012—2016年各年AIDS住院患者分枝杆菌检出情况

表2 不同类型样本分枝杆菌分离情况

2.4 MTB药物敏感性试验结果

对128株MTB进行一线抗结核药物的耐药分析。MTB对利福平、链霉素、乙胺丁醇和异烟肼的耐药率分别为18.75%、28.13%、15.63%和32.03%。根据2013年世界卫生组织对耐多药结核病(multidrug-resistant tuberculosis,MDRTB)的定义——结核病患者感染的MTB药物敏感性试验证实至少同时对异烟肼和利福平耐药,确定128株MTB菌株中,耐多药结核分枝杆菌共23株,MDR-TB耐药率为17.97%。

表3 MTB和NTM的本本分布情况

表4 128株MTB药物敏感性试验结果

3 讨论

NTM是指MTB及麻风分枝杆菌以外的所有分枝杆菌。随着人们对NTM认识的深入以及分枝杆菌菌型鉴定技术的发展,NTM的检出率也越来越高。NTM广泛存在于自然环境中,包括土壤和水,为条件致病菌,目前尚无NTM在人与人之间相互传播的证据。人类感染的NTM主要来源于生活环境,其中肺部NTM感染的病例较多[6]。对于AIDS等免疫缺陷患者,NTM的分离率也较高。近年来,NTM在AIDS患者中的感染上升趋势明显,成为AIDS合并机会性感染的重要病原体之一[7]。

目前,龟-脓肿分枝杆菌复合群和鸟-胞内分枝杆菌复合群为人类主要NTM致病性菌种[8-10]。NTM感染患者常无明显临床症状,而肺部感染患者常表现出与MTB感染相似的症状,临床难以区分[8]。由于NTM与MTB感染在致病机制和防治策略上存在差异,准确区分MTB和NTM感染很有必要。现行的分枝杆菌菌种鉴定试验主要有传统的对硝基苯甲酸(p nitro benzoicacid,PNB)/噻吩-2-羧酸酰肼(2-thiophenecarborylicacid hydrazide,TCH)改良罗氏法、免疫胶体金法或荧光探针聚合酶链反应,传统的PNB/TCH改良罗氏法将分枝杆菌初步分为结核复合群、牛结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌,但耗时较长,需要28 h才能报告结果;荧光探针聚合酶链反应虽然仅3 h即可报告结果,但需特殊仪器,对实验室环境和技术人员要求高,在大部分基层实验室难以推广。相比较而言,胶体金法各项分析指标(敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值)均高于PNB/TCH改良罗氏法,且检测所需时间仅为15 min,与荧光探针聚合酶链反应(3 d)和传统法(28 d)比较,具有明显优势。因此,培养法结合基于MPB64的胶体金法对分枝杆菌的鉴定具有快速、经济、操作方便、无须大型仪器投入的优点,有望在结核病诊断中被广泛应用,是对现有结核病细菌学检测手段的有益补充。

上海地区NTM感染情况目前尚未见文献报道,胡忠义等[11]对上海地区1987—1996年分离自患者肺部的5 619株分枝杆菌做菌型鉴定时发现,2.3%的分枝杆菌为NTM。本研究通过分析1 940例AIDS住院患者分枝杆菌感染及NTM分离情况来推测NTM在AIDS等免疫缺陷患者中的流行状况。从分枝杆菌分离情况来看,1 940例AIDS患者中有420例患者分枝杆菌培养阳性,阳性率达21.65%;共送检患者样本4 648例,阳性样本892例,阳性检出率为19.19%;共分离出不重复菌株409株,包含199株MTB(48.66%)和210株NTM(51.34%)。分枝杆菌分离鉴定结果提示上海地区AIDS患者中NTM感染比例较大,感染情况较MTB感染更为严重。样本来源分布显示,MTB和NTM主要分布在痰液样本中。2012年,MCCARTHY等[3]对东南亚地区AIDS患者的NTM感染情况进行分析时发现,来自越南、泰国和柬埔寨的AIDS患者中,有13%的患者合并MTB感染,11%的患者合并NTM感染;而泰国与越南AIDS患者NTM占分枝杆菌培养阳性样本的64%,与上海地区AIDS患者NTM感染情况一致;并且他们发现高效抗逆转录病毒治疗能够降低AIDS患者的NTM感染率。

药物敏感性试验结果显示,从AIDS患者中分离的MTB对链霉素和异烟肼的耐药率均较利福平和乙胺丁醇高,且多重耐药率增高,达到17.97%。因未常规开展NTM药物敏感性试验,且未对NTM进行菌株的鉴定是本研究的不足。2017年《非结核分枝杆菌肺病治理指南》[12]提出,不同的NTM在治疗前需进行的药物敏感性试验所需药物不同,如需操作和报告药物敏感性试验结果应遵循美国临床实验室标准化协会的要求进行药物敏感性试验。同时,单纯的敏感或耐药已不能满足临床需求,最低抑菌浓度和临界浓度更有指导意义。但本研究的回顾分析结果表明,上海地区AIDS患者NTM阳性分离率很高,有效的预防NTM感染的措施应成为NTM感染研究的主要方向之一。

综上所述,上海地区AIDS患者NTM感染严重,及早对HIV感染合并NTM感染患者进行诊断,有利于早期防治NTM感染,最大程度地减少NTM感染给患者带来的危害。

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