自噬相关蛋白mTOR、LC3-Ⅱ及HIF-1α与PM/DM的相关性※

钟 勇，柴克霞

(1.青海大学，810016；2.青海大学附属医院，810001)

多发性肌炎(polymyositis，PM)和皮肌炎(dermatomyositis，DM)是特发性炎性肌病最常见的两种亚型，目前发病机制尚不明确，研究认为可能与血管新生、炎症反应、自噬等相关。自噬及其相关蛋白在参与调控免疫应答和控制过度炎症反应中发挥重要作用[1]。微管轻链I蛋白3-II型(microtubule-associated protein light chain，LC3-Ⅱ)是表达于自噬小体的特异性分子标志，在自噬晚期阶段表达，能够反映自噬的表达水平[2]。自噬具有多条调节通路，其中哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(the mammalian target of rapamycin，mTOR)与真核细胞的自噬、增殖和凋亡等多个过程相关，参与了多条自噬调节通路并且可抑制自噬。研究表明[3]，低氧可以诱导自噬，同时参与了PM和DM的发病过程[4]，低氧诱导因子-1α(hypoxia induced factor-1α，HIF-1α)的过表达可使LC3-I向LC3-Ⅱ转化[5]，促进自噬的产生，其在PM和DM中是否也能诱导自噬的产生，尚未明确。本研究应用免疫组化法检测PM/DM患者肌肉组织中LC3-Ⅱ、mTOR和HIF-1α的表达水平，并且结合MDAAT+VAS评分[6]对疾病活动度进行评估，研究探讨自噬相关蛋白mTOR、LC3-Ⅱ及HIF-1α在PM/DM发病中的作用及意义。

1 对象与方法

1.1 研究对象及分组

选取青海大学附属医院风湿免疫科2014～2017年的PM/DM初治患者作研究对象。PM组：男2例，女8例，年龄19～53岁，平均年龄44.5±10.7岁；DM组：男4例，女6例，年龄22～63岁，平均年龄40.3±11.2岁。Control(对照)组：选取2015年青海大学附属医院单纯骨科创伤患者20例，其中男5例，女15例，年龄17～72岁，平均年龄53.4±18.9岁。各组间年龄、性别差异无统计学意义。研究对象纳入标准：PM/DM诊断标准采用Bohan和Peter于1975年制定的PM/DM诊断标准[7]。

1.2 标本的采集及处理

PM及DM组选取肱三头肌受累最重处的肌肉组织行肌肉活检。Control组肌肉组织选取单纯骨科创伤部位旁的正常肌肉组织。所有标本用10%的福尔马林溶液固定、石蜡包埋后制片行免疫组织化学染色。

1.3 LC3-Ⅱ、mTOR、HIF-1α水平的测定

1.4 统计学处理

统计学处理采用SPSS 19.0统计软件。计量资料以均数±标准差表示，多个样本的均数比较采用单因素方差分析；相关性分析采用Pearson相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组间HIF-1α、LC3-Ⅱ、mTOR的表达

PM组和DM组mTOR的阳性表达均低于Control组(P<0.05)，PM组和DM组之间比较mTOR，它们的阳性表达水平差异无统计学意义(P>0.05)；PM组和DM组LC3-Ⅱ的阳性表达水平均高于Control组(P<0.05)，PM组和DM组之间比较LC3-Ⅱ，它们的阳性表达差异无统计学意义(P>0.05)；DM组HIF-1α的阳性表达水平高于Control组和PM组(P<0.05)，PM组和Control组之间比较HIF-1α的表达差异无统计学意义(P>0.05)。详细数据见表1。

2.2 MDAAT+VAS评分

DM组MDAAT+VAS评分为7.20±2.66分；PM组为6.40±2.07分。

2.3 相关性分析

PM组和DM组中的mTOR与LC3-Ⅱ的平均光密度值均呈负相关(相关系数分别为-0.739、-0.740，P<0.05)，见图1、2；PM组和DM组中LC3-Ⅱ平均光密度值与MDAAT+VAS评分呈正相关(相关系数分别为0.848、0.811，P<0.05)，见图3、4；PM组和DM组中mTOR平均光密度值与MDAAT+VAS评分无明显相关性(P>0.05)。PM组和DM组中HIF-1α与LC3-Ⅱ、mTOR的平均光密度值及MDAAT+VAS评分均无显著相关性(P>0.05)。

Table 1The average optical density of mTOR，LC3-Ⅱ and HIF-1α in each

*：与Control组比较，P<0.05

图1 PM组LC3-II与mTOR的相关分析图

图2 DM组LC3-II与mTOR的相关分析图

图3 PM组LC3-II与MDAAT+VAS评分的相关分析图

图4 DM组LC3-II与MDAAT+VAS评分的相关分析图

3 讨论

PM/DM的发病机制复杂，有研究认为其主要类型机制有免疫和非免疫两种。非免疫机制包括内质网应激、缺氧、自噬和凋亡等[4]。mTOR是一种进化保守的非典型丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。可整合多种细胞外信号，如缺氧、应激等[9，10]。本研究结果显示，mTOR在PM组和DM组中的表达均低于Control组，提示mTOR参与了PM/DM的发病过程。Souvik Kar[11]等研究表明血管内皮生成因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)可以与细胞膜上的受体结合，负调控PI3K/AKT信号通路，该通路是mTOR的主要调节通路，可以上调mTOR的表达[12]，而VEGF在PM/DM中表达增强[13]。因此我们认为，通过VEGF负调控mTOR的表达，mTOR在PM/DM的表达减少。另外，有研究认为[14]PM/DM存在缺氧情况，在缺氧条件下，ATP生成减少，ATP/AMP比值降低，AMP依赖的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)被激活，mTOR表达被抑制，PM/DM中的mTOR表达下调也可能由缺氧引起。mTOR是一种转录调控因子，能够调控基因、促进血管新生[15]；另外自噬参与了PM/DM的发病[16]，其具体的参与机制尚不明确。mTOR作为自噬启动的上游关键调节因子，可以通过磷酸化ATG13和ULK1，使ULK1-ATG13-FIP200复合物形成受阻，从而负调控自噬[12]。由于PM/DM中mTOR的表达受到抑制，其对自噬的抑制作用减弱，自噬反应在PM/DM中增强。mTOR可能通过调节血管新生和自噬参与PM/DM的发病过程。

LC3-Ⅱ是自噬的标志性蛋白，结合在自噬小体膜上，参与自噬的延伸过程，能够间接反映自噬水平[2]，常作为反映自噬强度的指标[17]。本研究结果显示，LC3-Ⅱ在PM/DM组的表达水平均高于Control组，说明LC3-Ⅱ参与了PM/DM的发病过程。bcl-2可以与Beclin-1结合，下调Beclin-1依赖的自噬水平[18]。且PM/DM存在内质网应激机制[4]，当发生内质网应激时，bcl-2结合于内质网，其对自噬的对抗作用受到抑制，自噬增强[19]，LC3-Ⅱ表达上调。因此，内质网应激可能上调PM/DM中自噬的水平，进而使得LC3-Ⅱ的表达增强。研究还证实主要组织相容性复合体1(major histocompatibility complex class I，MHC-1)在PM/DM中表达增强[20]，可以促进细胞自噬和内质网应激[21]，MHC-1通过上调自噬增强LC3-Ⅱ在PM/DM中的表达。由此我们认为，上述两种机制可使LC3-Ⅱ的表达在PM/DM中增强。内质网降解增强子—α甘露糖苷酶样蛋白1(ER degradation-enhancing alpha mannosidase-like protein，EDEM1)在细胞质中被自噬降解，进而由EDEM1所致的对内质网的降解作用减弱[4]。因此，自噬也可以反过来通过促进内质网的应激反应，参与PM/DM的发病过程。

PM组和DM组中LC3-Ⅱ的表达与mTOR的表达呈负相关，mTOR可能通过负调控自噬，参与了PM/DM中LC3的上调；本研究结果还显示LC3-Ⅱ的表达水平与MDAAT+VAS评分呈正相关，提示LC3-Ⅱ的表达水平可能与疾病活动度有关：随着疾病活动度增强，LC3-Ⅱ的表达也增强。

HIF-1α作为一种低氧诱导因子，参与肿瘤、血管新生、自噬[22-24]等多个病理生理过程。本研究结果显示，HIF-1α在DM组中的表达高于PM组和Control组。低氧环境下，HIF-1α的降解被抑制，表达增强。有研究认为[14]PM/DM肌肉组织中存在缺氧机制，因此，DM肌肉组织的缺氧导致了HIF-1α的表达上调。VEGF是HIF-1α的一个靶基因，HIF-1α能够上调VEGF的表达，促进血管新生[22]。有研究显示VEGF在PM/DM中表达增强，且在DM中的表达高于PM组[13]，这与本研究结果相符。HIF-1α通过上调VEGF的表达，促进DM肌肉组织中血管新生，参与DM的发病过程；HIF-1α还可以负调控凋亡抑制因子bcl-2的表达，促进细胞凋亡，HIF-1α可能通过该机制参与DM的发病过程。

综上所述，自噬相关蛋白mTOR及LC3-Ⅱ参与了PM和DM的发病过程，HIF-1α参与了DM的发病过程，且LC3-Ⅱ与疾病的活动度相关。但因样本数有限，加之自噬的调节与许多因素相关，故本研究结论有待进一步验证。