青链霉素胁迫下甜菜碱对大肠杆菌及枯草芽孢杆菌的影响※

姜枚辰，华玉美多，毕齐茂，许宝可，张得钧

(青海大学生态环境工程学院，青海 西宁 810016)

动物身体中的正常菌群对外来细菌的大量增殖有着很强的抑制作用[1]。正常状态下的菌群可以对人体的生长发育起到良好的促进作用，比如合成人体所需的维生素[2]。有研究表明，IHFA小鼠离乳前用阿莫西林处理导致菌群结构显著改变，停药至成年后菌群不能完全恢复[3]。抗生素滥用已成为引起动物体内菌群失调的重要原因，抗生素在杀死导致感染的有害细菌的同时，也损害了正常的体内菌群，临床上常表现为便次增多、水样便、粘液便或脓血便等不同程度的菌群紊乱[4]。

甜菜碱有很强的药理活性，具有很大的开发利用价值，是一种发展前景广阔的化合物[5]。在干酪乳杆菌发酵中，甜菜碱可以起到与吐温80相似的渗透保护作用，改善乳酸产量且无需改变任何工艺条件[6]。有研究指出甜菜碱可以提高微生物对高盐高温环境的抵抗能力，可以有效保护细菌的生长，而目前对甜菜碱的研发应用主要集中在动植物方面，对微生物影响的研究较少且结论不一[7-8]。因此本文对甜菜碱在胁迫条件(青链霉素)下对革兰氏阴、阳性菌(大肠杆菌、枯草芽孢杆菌)生长的影响进行了初步研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

枯草芽孢杆菌、大肠杆菌(青海大学生态环境工程学院微生物实验室)。

1.1.2 主要试剂

甜菜碱(北京索莱宝科技有限公司)，Tryptone(广州捷倍斯生物科技有限公司)，Yeast extract(oxoid公司)，NaCl(天津市河东区红岩试剂厂)，青链霉素混合液(索莱宝生物科技有限公司)。

1.1.3 主要仪器

酶标仪(Thermo，MULTISKAN GO)，高压灭菌锅(HIRAYAMA，HEV-50)，双层恒温摇床(上海智城分析仪器制造有限公司，ZWYR-G2402)，无菌操作台(苏州净化设备有限公司，LED-3)。

1.2 方法

1.2.1 LB培养基的配置

称取Tryptone 10 g，Yeast extract 5 g，NaCl 10 g，放置于1000 mL烧杯中，加入约800 mL去离子水，充分搅拌溶解，然后用去离子水将培养基定容至1000 mL。高温高压灭菌后，冷却至室温，4 ℃保存。

1.2.2 甜菜碱毒性试验

采用试管比浊法进行试验：将11只带棉塞的灭菌试管编号。按表1所示进行培养基的配置。试验重复三次。将试管在摇床(37℃，220r/min)培养8 h后取200 μL培养液，于700 μm波长处进行检测，结果取平均值。

表1甜菜碱LB培养基配置表

Table 1Betaine LB medium configuration table

1.2.3 甜菜碱与青链霉素协同试验

采用试管比浊法进行试验：取带棉塞的灭菌试管15只，平均分为A、B、C三组。A组培养基内加青链霉素，B组加不同浓度的青链霉素和一定浓度的甜菜碱，C组加一定浓度青链霉素和不同浓度甜菜碱，具体配置方法见表2，每组做3组平行研究，培养24 h后在700 μm波长处进行检测，结果取平均值。另取试管两只，一只加培养基，另一只加培养基和菌液用作空白对照。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 甜菜碱组结果

在不同浓度甜菜碱(10～900μg/mL)条件下，大肠杆菌与枯草芽孢杆菌都表现为生长状态良好，且不同浓度下其生长情况无显著性差异(P>0.05)。由此可见高浓度甜菜碱对革兰氏阴、阳性菌生长无抑制作用，甜菜碱对革兰氏阴、阳性菌无毒性。数据见表3。

表2甜菜碱与青链霉素组配置表

Table 2Betaine and Penicillin+Streptomycin Group Configuration

Table 3Results of Betaine toxicity

2.2 青链霉素与甜菜碱交互组结果

青链霉素对革兰氏阴、阳性菌具有抑制作用，且随着青链霉素浓度的增加抑菌能力逐渐增强。在20～100 μg/mL青链霉素条件下，加入250 μg/mL甜菜碱后大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的菌数均有了一定程度的增加，与不加甜菜碱的同浓度青链霉素组比较其生长情况有显著性差异，由此可见，在一定浓度的青链霉素胁迫下，甜菜碱可以起到保护革兰氏阴、阳性菌的作用；在30 μg/mL青链霉素的影响下，革兰氏阴、阳性菌的菌数随甜菜碱的浓度增加而增加，这反映了甜菜碱对革兰氏阴、阳性菌具有一定的保护作用，且这种保护作用随甜菜碱的浓度的升高而加强。证明甜菜碱可以对青链霉素产生拮抗作用，对革兰氏阴、阳性菌有着较好的保护作用(表4)。

Table 4Results of betaine and Penicillin+Streptomycin

续表：

组别浓度(μg/mL)青链霉素甜菜碱n大肠杆菌24 h吸光度值枯草芽孢杆菌24h吸光度值青链霉素+甜菜碱(B)202590.412±0.01705∗0.397±0.00863∗602590.338±0.01625∗0.364±0.00879∗1002590.113±0.00580∗0.086±0.00728∗1402590.049±0.01034∗0.048±0.01135∗1802590.052±0.00328∗0.046±0.00501∗青链霉素+甜菜碱(C)30590.355±0.001243∗0.360±0.00432∗301590.363±0.001478∗0.381±0.00514∗302590.371±0.02430∗0.389±0.00478∗303590.380±0.002191∗0.397±0.00701∗304590.417±0.002762∗0.405±0.00649∗空白无菌组0010.0460.046正常组0010.4230.417F13.3875.479P<0.0010.004

*：与青霉素各不同浓度小组比较有显著差异

3 讨论

正常菌群被视为机体健康的确定原因，体内菌群构成的改变和菌群不平衡与健康状况的改变有关[9]。菌群作为调节人体内环境的一个重要因素，影响着宿主的营养、代谢及免疫[10-12]。

抗生素的使用除了破坏正常菌群肠道定植抗力及影响菌群类别外，对整个肠道的微生物代谢环境及该微生态系统与宿主之间的相互作用也有影响[13]。相关的调查结果显示，我国的患者在住院期间有80%的人使用抗生素，而在英国则为22%；我国的住院患者有58%的人使用广谱抗生素，或者联合使用两种或者两种以上的抗生素，这比国际水平高出30%[14-15]。

本研究采用了试管比浊法，对革兰氏阴、阳性菌的生长情况进行了测定。研究表明，甜菜碱对革兰氏阴、阳性菌生长无明显抑制作用，且甜菜碱在细菌不利生长条件下(青链霉素作用下)对革兰氏阴、阳性菌起到了明显的保护作用。

在适宜细菌培养条件下，甜菜碱浓度在10～900 μg/mL时对革兰氏阴、阳性菌生长均无明显影响，与空白组相比，革兰氏阴、阳性菌生长情况无明显差别；在25 μg/mL甜菜碱的影响下，细菌在20～100 μg/mL青链霉素胁迫下，大肠杆菌与枯草芽孢杆菌的长势明显好转；在30 μg/mL青链霉素胁迫下甜菜碱对革兰氏阴、阳性菌的保护作用随甜菜碱浓度的增加而增强。

本研究结果显示，900 μg/mL的甜菜碱对革兰氏阴、阳性菌无毒害作用，并且发现该浓度的甜菜碱对青链霉素起到一定的拮抗作用，这可能与甜菜碱具有的微生物的渗透调解机制有关，在双抗存在的情况下甜菜碱可以对革兰氏阴、阳性菌起到一定的保护作用。长久以来甜菜碱被认为是一种用来预防慢性病的安全高效的重要营养素，这使得甜菜碱应用于抗生素造成的肠道菌群紊乱成为可能[16-17]。本研究只阐述了甜菜碱对革兰氏阴、阳性菌的保护作用，该保护作用的机制还有待进一步阐明。