高原三倍体虹鳟石蜡切片制作方法的改良与验证※

韩步鹰，李长忠，马 睿，刘小红，千康康，侯建华，东国才，陈殊婷，孟玉琼

(青海大学生态环境工程学院，青海 西宁，810016)

石蜡切片制备步骤繁多，制备过程包括组织取材、固定、冲洗、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、贴片、烤片、脱蜡、染色及封存等步骤。根据不同组织结构特点不同导致其制备方法也不尽相同。有研究表明，脱水和透明程序是石蜡组织切片制作中至关重要的环节，也是影响组织形态学研究的重要因素[1]。因此，要制出优质的石蜡切片，需要不断的摸索和改进制备条件。

本研究通过优化制作的高原三倍体虹鳟不同组织石蜡切片，观察高原三倍体虹鳟鳃、肝脏和肠道组织的基本组织形态学特点。

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.1 常规方法

将固定好的组织用水多次冲洗去除固定液，分别按照不同程序进行组织的脱水和透明(见表1)。

表1本研究所采用的脱水及透明时间(min)

Table 1Dehydration and transparency time used in this study(min)

透明后的组织于60 ℃浸蜡2 h并包埋，修块后采用切片机(LEICA，RM2235)将蜡块切成6 μm厚的薄片，贴片和烤片后采用苏木精-伊红进行染色，染色步骤如下：

(1)脱蜡水化：将烤干的切片分别放入以下溶液中并保持一定的时间：二甲苯(Ⅰ)5分钟、二甲苯(Ⅱ)5分钟、无水乙醇5分钟、95%乙醇2分钟、80%乙醇2分钟、70%乙醇2分钟和蒸馏水2分钟。

(2)染色：对于上述处理好的样品，用苏木素染色5分钟，自来水冲洗数次洗去残留的染色液后用蒸馏水洗涤。再以1%盐酸酒精分化液分化30秒，期间用显微镜检查，当其分色鲜明时用流水冲洗切片数次。放入伊红染色溶液中染1分钟。

(3)脱水和透明：将切片依次浸入95%酒精(Ⅰ)、95%酒精(Ⅱ)、100%乙醇(Ⅰ)和100%乙醇(Ⅱ)中停留1分钟，然后将切片放入等体积比的无水酒精和二甲苯、二甲苯(Ⅰ)和二甲苯(Ⅱ)中，分别停留1分钟。

(4)封存：将含组织材料的载玻片从二甲苯中取出放在吸水纸上，用胶头滴管吸取中性树胶滴在切片的中央，用小镊子轻轻地夹住盖玻片的右侧，稍微倾斜使其左侧与封藏剂接触，缓慢放下盖玻片，尽量减少气泡的产生。最后将封好的切片放在托盘于37 ℃的恒温箱中干燥后进行观察。

1.2.2 优化方法

参考以上常规方法，首先让组织脱水脱过，得出最短透明时间；然后，不断缩短组织的脱水时间，直至组织不能在二甲苯中透明，前一步时间即最短脱水时间；最后通过切片染色来判断实际的效果。优化后的脱水及透明程序见表2。

表2不同组织最佳脱水及透明时间(min)

Table 2Optimal dehydration and transparent time of different tissues(min)

2 结果与分析

2.1 不同脱水及透明程序对高原三倍体虹鳟肠道组织显微结构的影响

注：A1、B1和C1分别代表A、B和C处理组10倍物镜下组织切片显微结构图； A2、B2和C2分别代表A、B和C处理组40倍物镜下组织切片显微结构图。
图A1：1-浆膜；2-肌层；3-粘膜下层；4-粘膜层；图A2：1-固有层；2-上皮细胞；3-杯状细胞。

图1不同脱水及透明程序对高原三倍体虹鳟肠道组织的影响

Figure1EffectsofDifferentDehydrationandTransparentProceduresontheIntestinalTissueofPlateauTriploidRainbowTrout

不同脱水及透明程序对高原三倍体虹鳟肠道组织的影响如图1所示，A处理组镜下组织结构完整，厚薄均匀、无裂痕，染色鲜艳，细胞形态清晰。浆膜、肌层、上皮细胞和杯状细胞等显微结构清晰可见。B处理组镜下组织产生脆裂，染色不均匀，浆膜和肌层中间产生空隙分层，有粘膜层脱落，组织结构不完整。C处理组镜下组织产生严重裂痕，染色效果暗淡。

2.2 不同脱水及透明程序对高原三倍体虹鳟肝脏组织显微结构的影响

注：A1、B1和C1分别代表A、B和C处理组10倍物镜下组织切片显微结构图；A2、B2和C2分别代表A、B和C处理组40倍物镜下组织切片显微结构图。

图2不同脱水及透明程序对高原三倍体虹鳟肝脏组织的影响

Figure2EffectsofDifferentDehydrationandTransparentProceduresonLiverTissueofPlateauTriploidRainbowTrout

不同脱水及透明程序对高原三倍体虹鳟肝脏组织的影响如图2所示，A处理组镜下组织产生皱缩现象，组织形态发生改变。B处理组镜下组织形态清晰完整，染色鲜艳，无裂痕皱缩现象。C处理组10倍镜下组织类似絮状物，结构发生严重变形。

2.3 不同脱水及透明程序对高原三倍体虹鳟鳃组织显微结构的影响

注：A1、B2和C3分别代表A、B和C处理组10倍物镜下组织切片显微结构图；A2、B2和C2分别代表A、B和C处理组40倍物镜下组织切片显微结构图。
图A2：1-呼吸上皮细胞；2-柱细胞；3-血窦。

图3不同脱水及透明程序对高原三倍体虹鳟鳃组织的影响

Figure3EffectsofDifferentDehydrationandTransparentProceduresonGillTissueofPlateauTriploidRainbowTrout

不同脱水及透明程序对高原三倍体虹鳟鳃组织的影响如图3所示，A处理组镜下组织结构完整，染色鲜艳，细胞形态清晰。高倍镜下呼吸上皮细胞、柱细胞和血窦清晰可见。B处理组镜下组织产生脆裂，组织结构不完整，高倍镜下鳃丝组织已经严重变形。C处理组部分鳃丝已经解体，染色效果暗淡。

2.4 最佳脱水及透明程序对高原三倍体虹鳟不同组织的影响

注：A1、A2和A3分别代表肠道组织在物镜为10倍、20倍和40倍下组织切片显微结构图。B1、B2 和B3分别代表肝组织在物镜为10倍、20倍和40倍下组织切片显微结构图。C1、C2和C3分别代表鳃组织在物镜为10倍、20倍和40倍下组织切片显微结构图。
图A1：1 浆膜；2 肌层；3 粘膜下层；4 粘膜层；图A3：1 固有层；2 上皮细胞；3 杯状细胞；图B2：1 肝细胞；2 肝血窦；图C2：1 鳃小片；2 鳃丝；3 鳃丝软骨；图C3：1 呼吸上皮细胞；2 柱细胞；3 血窦。

图4最佳脱水及透明程序对高原三倍体虹鳟不同组织的影响

Figure4EffectsofOptimalDehydrationandTransparencyProceduresonDifferentTissuesofPlateauTriploidRainbowTrout

对不同组织的石蜡切片制作程序优化结果如图4所示，最佳脱水和透明程序下的肠道、肝脏和鳃的组织切片薄厚均匀、无皱折、切面组织结构完整。细胞结构形态清晰，染色鲜艳，细胞核与细胞质蓝红对比明显，肠道切片轻微缢缩，组织无裂隙。并且发现高原三倍体虹鳟鳃、肠道和肝脏组织脱水及透明时间存在差异，其中肠道组织所需脱水时间最短，肝脏组织透明时间最长。

3 讨论

整个石蜡切片过程虽然并不复杂，但要制出优质的切片，需要根据研究对象的不同，不断的摸索和改进制备过程。脱水和透明程序是石蜡组织切片制作中至关重要的步骤，影响着最终切片质量的好坏。脱水的目的是把组织中的水分彻底脱除，有利于组织的透明、浸蜡及永久保存。通常采用梯度酒精浸泡逐渐取代组织中水分，以保证组织彻底脱水并避免组织过度收缩和硬化。然而，乙醇的浓度及处理时间会显著影响生物组织的物理特性。长时间低浓度乙醇处理会导致组织变软，助长材料的解体；而长时间高浓度乙醇处理则会导致组织收缩变硬[2]，进而产生脆裂乃至无法展片的现象。本研究发现鳃组织在B处理脱水及透明程序下明显产生鳃丝解体现象，这可能由于在低浓度乙醇中每级停留时间太长，使组织变软，C脱水和透明程序下，由于在高浓度乙醇中每级停留太长时间，使鳃组织产生收缩现象。肝脏组织在A处理脱水透明程序下明显产生皱缩现象，这可能与脱水时间过短有关。

脱水后的材料在浸蜡前，还必须经过透明处理。透明是指采用透明剂置换组织内的脱水剂，透明与脱水环节息息相关，一般来说，脱水越充分，透明效果就越好[3]。随着时间的推移，组织逐渐变得通透，最终呈透明状，使得组织呈现透明状以利于显微镜下观察，同时为下一步的浸蜡起到桥梁作用，一般采用二甲苯进行。二甲苯不仅可替代组织中的酒精，又能溶解石蜡以利石蜡的渗入，是目前被广泛应用的一种透明剂。然而，高浓度的二甲苯会引起组织强烈收缩[4]，所以要先用无水酒精与二甲苯等比例混合液进行透明预处理，再用二甲苯进行透明。且透明时间不宜过长，过长组织会出现脆裂现象，一般2小时左右即可[5]。本研究发现肝脏组织在A处理脱水透明程序下明显产生皱缩现象，相反C脱水透明程序下出现脆裂现象，这可能与高浓度二甲苯中停留时间长短有关。

在对高原三倍体虹鳟石蜡组织切片制作方法研究的基础上，本研究进一步对其鳃、肝脏和肠道组织进行形态学观察。结果表明，高原三倍体虹鳟鳃组织由鳃弓和鳃丝组成，鳃弓由骨骼支持，每一片鳃由鳃弓、鳃耙及鳃丝构成，鳃丝呈长条形；肝脏组织主要由肝细胞构成，肝细胞多为多角形或近圆形，细胞核位于中央或偏移一侧，少许细胞存在两个细胞核；高原三倍体虹鳟肠道组织是由浆膜、肌层、粘膜下层和粘膜层构成的。粘膜层的中间是固有层、外围由柱状上皮细胞和杯状细胞构成。

通过与其他鱼类组织形态学研究对比发现，高原三倍体虹鳟组织形态结构与一般肉食性鱼类如哲罗鱼[6]、鳜鱼[7]和黄鳝[8]等类似，而与草食性和杂食性鱼类如鲢、鳙[9]和鲤鱼[10]不同。一般来说肉食性鱼类鳃耙短而稀疏，肠壁较厚，肠绒毛面积较大，肝细胞分布不均匀[11]。本研究发现高原三倍体虹鳟的鳃耙较稀疏，鳃丝呈长条形，肠壁较厚，杯装细胞较多，长绒毛面积较大，肝脏不与胰脏混杂，肝细胞核呈圆形或椭圆形，有时可见两个核，肝细胞索单列纵行，低倍镜下似云雾状，肝细胞分布不均匀，肝小叶区分不明显。王永翠等[12，13]研究发现鱼类消化道的形态组织结构与其生活环境和食物息息相关，食物丰富的鱼类消化道杯状细胞发达，与其组织结构上有更好的消化吸收机制密切相关。张娟娟等[14]在虹鳟的研究上发现肠绒毛面积与对营养物质的吸收相关。因此，不同养殖环境对于虹鳟组织形态学影响较大，系统研究高原三倍体虹鳟组织形态学对于理解其生理变化具有至关重要的意义。