葛根芩连汤干预DSS模型小鼠血清炎症因子的实验研究※

高 威，李 杰，任延明，刘 杰，曹成珠，纪巧荣，寇 娜，张 伟*

(1.青海大学医学院，青海 西宁 810001；2.青海大学，青海 西宁 810000)

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是一种病因不明的在大肠粘膜发生的慢性炎症和溃疡性病变[1]。病情轻重不等，且具有潜在的癌变可能性[2]。目前临床上主要应用柳氮磺胺吡啶、水杨酸制剂对UC进行治疗。本研究应用中药治疗模型小鼠UC，现将有关结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

健康未孕SPF级、雌性BALb/c小鼠48只，体重(22±2)g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXX(京)2012-0001，合格证号：11400700176022。

每组7只分开饲养，适应性喂养1 w后，随机分组，在第一部分实验中将小鼠分为四组：正常组、中药组和DSS组、中药+DSS组，实验周期7 d。正常组予洁净水自由饮用7 d的同时连续灌胃(0.9%NS，0.15mL·10g/d)；DSS组予3.5% DSS自由饮用7 d的同时连续灌胃(0.9%NS，剂量同上)；中药组予洁净水自由饮用7 d的同时连续灌胃(葛根芩连汤，0.15mL/10g·d[3])7 d；中药+DSS组在给予3.5% DSS自由饮用的同时连续灌胃(葛根芩连汤，0.15mL/10g·d)7 d。在第二部分实验中将小鼠分为四组：正常组、中药组和UC组、中药+UC组，实验周期14 d。正常组予洁净水自由饮用7 d后连续灌胃(0.9%NS，0.15mL/10g·d)7 d；UC组予3.5% DSS自由饮用7 d后改为饮用洁净水(7 d)；中药组予洁净水自由饮用7 d后连续灌胃(葛根芩连汤，0.15mL/10g·d)；中药+UC组造模成功后(予3.5% DSS自由饮用7d)连续灌胃(葛根芩连汤，0.15mL/10g·d)7 d。

造模成功与否判定：出现以下表现，表明UC模型造模成功，①造模3～5 d后出现大便溏泻，肛周有污物，甚至血便；②嗜卧；③毛色枯槁不荣；④食量明显下降；⑤光镜下见模型组小鼠结肠组织溃疡形成。

1.2 药物和试剂

DSS购自MBIO，商品编号：160110。葛根芩连汤依据《伤寒论》中要求的煎煮法制备：取葛根15 g，加入5倍量无菌蒸馏水，浸过中药液面，以文火煮至沸腾，沸腾10 min，再加入黄芩9 g、黄连9 g、甘草(炙)6 g，文火煮至沸腾，沸腾20 min，过滤后，续加五倍量蒸馏水，文火煮至沸腾，沸腾30 min后，再次过滤。将两次过滤所得药液混合，在文火上浓缩至39 mL，即为100%(1g/mL)的中药原液。ELISA试剂盒购自武汉博士德生物科技有限公司，IL-4货号：E-EL-M0043c；IFN-γ货号：E-EL-M0048c；TNF-α货号：E-EL-M0049c。

1.3 仪器

台式离心机购自德国(Sigma 3K15)，酶标仪购自瑞士(TECAN Infnite 200pro)。

1.4 标本

第一、二部分实验结束后，分别进行实验动物的标本收集：于心脏采血1 mL，在4 ℃条件下离心(4000r/min)15 min制备血清，低温保存备测。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 小鼠一般状况

正常组和中药组的小鼠整体表现正常，精神状态良好。模型组小鼠在自由饮用DSS 3～5 d后，毛发失荣，状态萎靡，喜卧，身体蜷缩，进水进食量明显减少，大便稀溏，有便血。给药后，中药+DSS组及中药+UC组小鼠一般状况均有改善。

2.2 葛根芩连汤对小鼠血清IL-4、IFN-γ、TNF-α表达的影响

结果显示，在造模过程中给药，DSS组和其他三组相比差异具有统计学意义(P<0.05)，而正常组和中药组相比，差异无统计学意义(P>0.05)；造模成功后给药，UC组和其他三组相比差异具有统计学意义(P<0.05)，正常组和中药组相比，差异无统计学意义(P>0.05)(见表1～2)。

组别nIL-4(pg/mL)IFN-γ(pg/mL)TNF-α(pg/mL)DSS组531.34±4.1728.42±0.9124.31±2.36正常组576.55±7.65※17.62±1.32※15.93±1.99※中药组577.01±7.42※16.49±0.63※15.52±1.77※中药+DSS组563.72±4.29※▲#20.59±1.22※▲#19.40±1.45※▲#F 61.587 129.861 22.447P 0.000 0.000 0.000

※：与DSS组比较，P<0.05；▲：与正常组比较，P<0.05；#：与中药组比较，P<0.05

组别nIL-4(pg/mL)IFN-γ(pg/mL)TNF-α(pg/mL)UC组543.47±6.3626.26±0.2323.82±3.16正常组575.99±7.10※17.41±1.06※15.92±2.02※中药组575.30±4.50※16.22±1.33※15.53±1.73※中药+UC组562.53±2.35※▲#22.14±0.56※▲#19.32±0.77※▲#F 39.708 130.374 16.756P 0.000 0.000 0.000

※：与UC组比较，P<0.05；▲：与正常组比较，P<0.05；#：与中药组比较，P<0.05

3 讨论

UC在传统医学中属于泄泻、痢疾等范畴，可归为中医的湿热病[4]。本研究以DSS诱导的UC小鼠为模型，研究葛根芩连汤对DSS造模前后小鼠血清IL-4、IFN-γ、TNF-α表达水平的影响，为临床诊断及治疗提供客观依据。

UC的发病机制至今不明，现代研究发现免疫因素在UC发病机制中尤为重要[5]。大量文献显示，许多细胞因子参与结肠粘膜的炎症免疫反应，与UC的发病及转归密切相关。众所周知，细胞因子可分为促炎因子和抑炎因子两大类，在正常人群中促炎因子如TNF-α等和抑炎因子如IL-4、IL-10等处于动态平衡状态，如若失衡，则会导致疾病的发生。

IL-4主要是由活化T细胞产生，能有效抑制炎性反应，有研究发现，IL-4对维持肠道免疫功能有重要的作用[6]。近年来有研究报道认为，UC的炎性反应程度与IL-4的表达有一定的相关性，可以用来评估UC的炎性反应程度[7]，IL-4是通过抑制Th1细胞的增殖功能来抑制肠道炎症的发生[8]。我们的研究显示，模型组小鼠血清IL-4蛋白表达水平显著降低，而予葛根芩连汤干预后，又明显增高，表明了葛根芩连汤具有促进IL-4蛋白表达的作用。

INF-γ主要由Th1淋巴细胞产生，是一种具有较强的免疫调节作用的淋巴因子，能引起肠道炎症反应[9]。TNF是一个主要的炎症介质，TNF-α主要是由巨噬细胞产生，对调节炎症反应起重要作用[10]。TNF-α可通过诱导血栓生成使肠黏膜血液循环发生障碍，进而导致肠黏膜组织广泛损伤[11]。 当与INF-γ协同作用时，可以杀伤上皮细胞，使炎症加重。且有研究发现，由Th1产生的INF-γ能够抑制Th2细胞的增殖，而由Th2细胞分泌的IL-4能抑制Th1反应[12]。本研究发现，在模型组小鼠血清中，INF-γ和TNF-α的表达显著升高，而在使用中药干预后，其表达又明显降低，表明了葛根芩连汤具有抑制INF-γ、TNF-α表达的作用。

根据对葛根芩连汤的现代研究，方中葛根的有效成分为葛根素，而葛根素具有明显的抗炎及抗氧化作用；黄芩的有效成分为黄芩苷，黄芩苷亦具有抗氧化、抗炎作用以及抗病原微生物的作用；黄连的有效成分为生物碱类，具有代表性的化合物有小檗碱，小檗碱具有较强的抗病原微生物的作用；甘草的有效成分为多糖类[13]，具有明显的抗炎及抗病毒作用。余林中等[14]研究了葛根芩连汤各配伍与抗腹泻药效之间的关系，结果显示在降低小肠推进率的影响中，以黄连与炙甘草发挥的作用为主。概而言之，葛根芩连汤具有抗菌、抗病毒、抑制胃肠运动、增强机体免疫功能等药理作用。

综上所述，本研究依据中、西医学理论，结合预实验经验，用DSS造模的方法成功建立了UC小鼠模型。在造模过程中及造模成功后予葛根芩连汤干预，小鼠血清IL-4、INF-γ和TNF-α表达结果显示葛根芩连汤在造模过程中能明显抑制促炎因子INF-γ和TNF-α的表达，促进抑炎因子IL-4的表达，表明了葛根芩连汤对小鼠结肠组织有明显的保护作用及治疗作用。