茶树菇富硒液体发酵培养基的优化
2019-01-08赵金凤刘朝贵
赵金凤 刘朝贵
（1重庆市渝北区经济作物技术推广站，重庆渝北401120；2西南大学园艺园林学院，重庆渝北401120）
茶树菇（Agrocybe cylindracea），隶属真菌门（Eumycophyta），担子菌纲（Basidomycetes），粪锈伞科（Bolbitiaceae），田菇属（Agrocybe），又名柱状田头菇，杨树菇，茶薪菇等[1]。目前对茶树菇的研究主要集中在液体发酵条件、培养基的筛选和其生物活性上。试验以茶树菇为载体，研究了其富硒液体发酵培养条件，现将试验结果总结如下。
1 材料与方法
1.1 试验菌株
茶树菇菌株由西南大学蔬菜实验室提供。
1.2 培养基
1.2.1 基础平板培养基
PDA培养基[2]。
1.2.2 液体种子培养基
葡萄糖 20 g，蛋白胨 4 g，KH2PO43 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，VB10.01 g，加水1 L，pH自然。
1.2.3 基础液体培养基
葡萄糖20 g，蛋白胨2 g，KH2PO43 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，Na2SeO35 mg，VB10.01 g，水1 L，pH自然。
1.2.3.1 碳源单因素试验基础培养基
将基础液体培养基里的碳源替换为葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、麦芽糖、乳糖。
1.2.3.2 氮源单因素试验基础培养基
将基础液体培养基里的氮源替换为牛肉膏、黄豆粉、酵母膏、氯化铵、蛋白胨。
1.2.3.3 pH单因素试验基础培养基
将基础液体培养基的pH设定为5、6、7、8。
1.2.3.4 维生素单因素试验基础培养基
将基础液体培养基里的维生素替换为VB1、VB2、VB6
1.2.3.5 液体发酵正交设计
在单因素试验基础上，以菌丝生物量（干）（后文菌丝生物量均指干重）、硒含量、富硒率和胞内硒多糖的产量为考察指标，采用L9（34）正交试验对碳源（A）、氮源（B）、pH（C）、维生素（D）4个因素进行优化。富硒液体发酵的正交试验结果见表1。
表1 富硒液体发酵的正交试验
1.3 试验方法
1.3.1 母种活化培养
将茶树菇接种于基础平板培养基上，（25±1）℃恒温培养，菌丝长满平板表面后待用。
1.3.2 种子培养基制作
取直径8 mm的活化茶树菇平板菌种8块接入装有100 mL已灭菌的液体种子培养基中，于25℃、120 r/min恒温摇床振荡培养10 d，得一级液体菌种。
1.3.3 菌丝培养
以10%的接种量将一级液体菌种接入装有100 mL已灭菌的二级液体培养基中，于25℃、120 r/min，转速恒温摇床振荡培养。每种培养基设3个重复。8 d后测定不同碳源、氮源、pH、维生素条件下菌丝生物量、硒含量和富硒率。
1.3.4 观察测定方法
1.3.4.1 茶树菇菌丝体生物量测定，参照参考文献[3]。
1.3.4.2 硒标准曲线制作
参照参考文献[4]。
1.3.4.3 有机硒含量测定
总硒含量测定参照参考文献[3]。样品不经消化处理，按上述测定总硒的方法测定无机硒含量。有机硒含量=总硒含量-无机硒含量。
富硒率计算方法：
2 结果与分析
2.1 硒标准曲线
按照方法1.4.2，绘制了硒标准曲线，由图1可知，标准硒溶液的浓度（x，μg/mL）和吸光度（y）在0～30 μg/L成线性关系。回归方程为：y=0.010x+0.008，R2=0.997。
图1 硒标准曲线
2.2 富硒茶树菇液体培养基的筛选
2.2.1 不同碳源对茶树菇菌丝生物量、硒含量及富硒率的影响
在碳源单因素试验中采用了5种不同的碳源（葡萄糖、淀粉、乳糖、蔗糖和麦芽糖）作为茶树菇液体富硒的碳源，研究这几种碳源对茶树菇菌丝干生物量、硒含量及富硒率的影响。由表3可以看出，这五种碳源茶树菇都能利用，从菌丝生物量、硒含量及富硒率方面看，都以葡萄糖为最好。当葡萄糖作为碳源时，菌丝生物量达0.29 g/50 mL，硒含量达49.5 μg/g，富硒率达5.81%。这与单糖更容易吸收，更有利于菌丝体生长的报道一致[6]。通过最小显著性检验（LSD）的结果可知，葡萄糖为碳源的菌丝生物量达到极显著性水平，富硒率和乳糖差异不显著。这五种碳源对含硒量的影响都不显著。从菌丝生物量、有机硒及富硒率三方面考虑，选用葡萄糖、麦芽糖、乳糖作为茶树菇富硒正交试验的碳源。
2.2.2 不同氮源对茶树菇菌丝干生物量、硒含量及富硒率的影响
在氮源单因素试验中也采用了5种不同的氮源（牛肉膏、黄豆粉、酵母膏、氯化铵、蛋白胨）作为茶树菇液体富硒培养的氮源，研究这几种氮源对茶树菇菌丝生物量、有机硒及富硒率的影响。从表4可以看出，不同的氮源对茶树菇菌丝生长有不同程度的作用，就菌丝生物量而言，有机氮的利用较无机氮好，这是因为食用菌能利用有机氮而不能利用无机氮。就含硒量而言氯化铵最好，这可能是因为菌丝生长缓慢在摇瓶过程中不断吸附亚硒酸钠，形成硒络合物，从而转化为有机硒。富硒率则以牛肉膏、黄豆粉、蛋白胨最好，与酵母膏和氯化铵差异显著。从菌丝生物量、有机硒及富硒率三方面考虑，选用肉膏、黄豆粉和蛋白胨作为茶树菇富硒正交试验的氮源。
2.2.3 不同pH对茶树菇菌丝生物量、硒含量及富硒率的影响
pH的大小会影响食用菌菌丝生长过程中酶的活性，pH过高或过低都会对某些酶的活性起到抑制作用，从而使菌丝的代谢减缓，影响菌丝生长。一般认为pH对酶活性的影响是通过细胞内H+或OH-影响酶蛋白的电荷及解离度，而改变酶的结构和功能来实现的。由表5可以看出，当pH为7时，菌丝生物量达到0.38 g/50 mL，与pH为5、6、8相比，菌丝生物量差异达到显著水平。当pH为5、8时，与pH为6、7相比，硒含量达到显著水平。pH为7、8时，与pH为5、6相比，富硒率达到极显著水平。综合菌丝生物量、有机硒及富硒率三方面考虑，试验选用pH为5、7、8作为茶树菇富硒正交试验的pH。
表3 不同碳源对茶树菇菌丝生物量、硒含量及富硒率的影响
表4 不同氮源对茶树菇菌丝生物量、硒含量及富硒率的影响
表5 不同pH对茶树菇菌丝生物量、硒含量及富硒率的影响
表6 不同维生素对茶树菇菌丝生物量、硒含量及富硒率的影响
2.2.4 不同维生素对茶树菇菌丝生物量、硒含量及富硒率的影响
采用了三种不同的维生素，且每种维生素设了两个不同的质量。从表6可以看出，维生素对菌丝生物量的影响较小，菌丝生物量之间没有显著性差异。维生素对硒含量的影响较大，当VB1为0.01 g时，硒含量达到49.50 μg/g，富硒率达到5.81%，硒含量和富硒率都达到极显著水平。综合菌丝生物量、有机硒及富硒率三方面考虑，试验选用VB10.01 g、VB10.005 g、VB20.005 g作为茶树菇富硒正交试验的维生素。
2.2.5 茶树菇富硒液体发酵正交实验优化
单因素试验初步筛选了适合茶树菇菌丝生长，具有较高硒含量和富硒率的较佳因子，为了考察这些因子的协同作用，按表1进行了正交试验，结果如表7所示。根据表7的极差分析比较，4种因素对茶树菇菌丝生物量影响大小依次为A＞B＞D＞C，碳源对菌丝生物量的影响最大。4种因素对茶树菇菌丝硒含量影响大小依次为B＞D＞A＞C，氮源对菌丝干生物量的影响最大。4种因素对茶树菇菌丝富硒率影响大小依次为A＞B＞D＞C，碳源对菌丝生物量的影响最大。综合考虑菌丝生物量、有机硒及富硒率，实际最优处理为：A3B3C2D1。由于三个指标的最优水平组合不一致，根据三个指标的主次关系，硒含量和富硒率才是试验最重要的指标，所以根据硒含量和富硒率极差优水平组合，提出预测优处理为：A3B3C1D1，按此组合进行最优验证试验。试验结果：茶树菇菌丝生物量为 0.23 g/50 mL，硒含量为58 μg/g，富硒率为5.34%。因此可以确定茶树菇富硒液体发酵的最优培养基为：乳糖 20 g，蛋白胨 2 g，KH2PO43 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，VB10.01 g，pH5，水1 L。
表7 富硒液体发酵的正交试验结果和极差分析
3 小结
通过单因子试验和正交试验筛选了茶树菇富硒及产胞内硒多糖的最佳培养基。但是本试验仅对液体发酵的碳源、氮源、pH和维生素进行了筛选，没有对碳氮比、无机盐等进行优化，这些问题还有待于进一步研究。
