辽白金针菇2号菌株选育初报

李 超 李 红 刘 娜 黄竹清

（1辽宁省农业科学院食用菌研究所，辽宁沈阳110161；2沈阳恒生生物科技发展有限公司，辽宁沈阳110500）

杂交育种是目前食用菌育种中应用最广泛、收效最显著的育种方法。通过遗传基因重新组合，在杂交后代中筛选出优良的新品种，利用双亲性状的优势互补或借助其中一个亲本的优点去克服另一亲本的缺点，方向性和目的性都比较明确[1]。杂交育种技术中以单孢杂交方法最精确，故应用较多[2]。金针菇（Flammulina velutiper）又名金菇、构菌、朴菇、冬菇等，是我国最重要大宗食用菌之一。金针菇是典型的四极性异宗结合食用菌，有性世代中，成熟的子实体在菌褶上形成无数的担子，每个担子上产生四个担孢子，利用不同菌株间产生的不同交配型的单核菌丝配对杂交形成双核菌丝的原理，可以选育出新的杂交菌株。依据此原理，笔者于2006年以来，一直进行单孢杂交育种，旨在选育出高产优质的金针菇杂交新菌株。现将辽白金针菇2号选育报道如下。

1 材料与方法

1.1 杂交亲本

白金针菇1号和韩白金针菇菌株均为辽宁省农业科学院食用菌研究所的保存菌株。

1.2 培养基

单孢子分离培养基：WA培养基。琼脂20 g，蒸馏水补足1000 mL。将所有培养基进行高压蒸汽灭菌，然后在超净工作台上将15 mL培养基倒入皮氏皿中或6 mL培养基加入试管中。

单核菌丝配对杂交培养基：PDA培养基。去皮马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，加水1000 mL，磷酸二氢钾3 g，硫酸镁1.5 g，pH自然。

栽培料基质：木屑30%，玉米芯30%，棉籽壳20%，麸皮18%，蔗糖1%，石膏1%。料含水量63%。

1.3 单孢子收集与分离

采集菇盖稍大的金针菇子实体，用无菌水冲洗并阴干，在超净工作台上把子实体固定在无菌采集皿中，于22℃培养3～5 d[3]。然后将装有孢子的培养皿密封好置于4℃冷藏备用。

在超净工作台上，用移液枪（10～100 μL）吸取少量无菌水，然后从培养皿中蘸取少量孢子粉注入1号三角瓶中搅拌均匀，从1号三角瓶中吸取5 mL悬液注入2号三角瓶搅拌均匀。依此稀释至第8号三角瓶，得到一系列孢子悬浮液[4]。

在显微镜下分别观察1～8号三角瓶中的悬浮液，选择400倍单个视野中含2～3个孢子的悬浮液为最佳接种液。

用移液枪吸取稀释最佳浓度的悬浮液0.5 mL到平板PDA培养基上，然后均匀涂布，倒置避光培养5～8 d，待孢子萌发。培养温度为22℃。

1.4 单核菌丝检查

新菌落萌发至直径为3～4 cm时，镜检单孢子萌发的菌丝，观察有无锁状联合，将无锁状联合的单核菌丝转接到PDA试管斜面上，22℃条件培养，待菌丝长满培养基后置于4℃条件保存备用。

1.5 单孢杂交

将白金针菇1号菌株和韩白金针菇菌株的单核菌丝接种在同一培养基平板上，接种点相距3 cm，22℃培养15～18 d。镜检单核菌丝结合处，如果发现锁状联合，说明配对杂交获得成功。

1.6 杂交新菌株选择与培养

将有锁状联合的杂交菌丝接种在PDA平板培养基上，22℃黑暗培养12 d，从杂交组合中选择菌丝生长速度快且菌丝生长势强的杂交菌株，取菌落边缘直径为0.6 cm的菌块转接于试管斜面上。观察菌丝生长势及色泽。采用十字交叉法测量菌落直径，计算菌丝生长速度。

图1 金针菇不同菌株间的拮抗试验

菌丝生长速度（mm·d-1）=菌落半径（mm）/生长时间（d）。

1.7 拮抗试验

在PDA平板内，采用三点接种法分别接种亲本菌株及杂交新菌株。每两点间距2 cm，接种后在22℃恒温箱培养，设定温度为22℃。观察记录各菌株间的拮抗反应。

1.8 酯酶同工酶电泳试验

取亲本及杂交菌株菌丝体，加入酶提取液在冰浴中研磨后，离心取上清液备用。采用聚丙烯酰胺垂直板凝胶电泳，将电泳后的凝胶浸入染色液中，观察两个亲本菌株及杂交新菌株的酯酶同工酶电泳图谱。

1.9 栽培对比试验

采用17 cm×35 cm×0.004 cm聚丙烯塑料袋，每袋装料折干250 g。接种后置于22～24℃培养室培养，菌丝满袋后进行搔菌，再移入出菇室进行出菇管理。每个菌株设3次重复，每个重复200袋。测定金针菇子实体的菌柄直径、菌柄长度、菌盖直径，总产量，以此计算金针菇生物学效率。

2 结果与分析

2.1 拮抗试验结果

杂交新菌株与白金针菇1号和韩白金针菇两个亲本菌株间的拮抗试验如图1所示。图1结果充分表明，三个菌株间的任意两个菌株均有非常明显的拮抗线。

2.2 金针菇亲本与杂交菌株酯酶同工酶电泳分析结果

白金针菇1号菌株、韩白金针菇菌株与金针菇杂交新菌株酯酶同工酶酶谱如图2所示。白金针菇1号菌株和韩白金针菇菌株与金针菇杂交新菌株均有一条共同酶带，Rf为0.312，图2中箭头1为亲本白金针菇1号特异酶带，Rf分别为0.165和0.395，箭头2为亲本韩白金针菇特异酶带，Rf为0.728；金针菇杂交新菌株既含有两条亲本白金针1号特异酶带，又含有一条亲本韩白金针菇特异酶带，只是酶带宽窄、浓淡略有不同。从蛋白质水平上证明金针菇杂交新菌株为亲本白金针菇1号和亲本韩白金针菇真正的杂交子。

图2 金针菇不同菌株间酯酶同工酶酶谱

2.3 金针菇杂交菌株菌丝生长性状测定结果

菌丝生长性状测定是一种对菌株活力和生长速度判定的非常简便有效快速的方法，在实际生产中经常采用，可初步地判断菌株的质量。由表1结果可看出，杂交菌株长势很好，粉孢子少，气生菌丝少，均一度较好，这些都是优良菌株的特征，符合优良栽培菌株的特性。

表1 金针菇亲本与杂交菌株菌丝生长速度及生长势比较

表2 金针菇亲本与杂交菌株农艺性状比较

表3 金针菇亲本与杂交菌株的子实体产量、生物学效率

2.4 亲本菌株与杂交菌株主要农艺性状比较

由表2和图3可知，金针菇杂交菌株具有菌盖小且不易开伞，菌柄长且较细的优良性状，而且菌柄基部无绒毛（大部分的白色金针菇菌株菌柄基部都有绒毛），可见，该菌株适合工厂化栽培。

2.5 金针菇杂交菌株子实体产量

从表3可以看出，金针菇杂交新菌株的子实体产量最高，平均生物学效率达到150.2%，比亲本白金针菇1号菌株高12.7%，比亲本韩白金针菇菌株高21.7%。

图3 金针菇亲本与杂交菌株的子实体形态特征

3 讨论

食用菌杂交育种是一种遗传物质在细胞水平上的重组过程[5]。金针菇单孢杂交育种，必须分离到单孢子或刚由单孢子萌发的单核菌丝，因此鉴别单核菌丝非常重要。

杂交新品种的鉴别是金针菇杂交育种的重要工作。试验从以下几个方面对金针菇杂交新菌株进行规范性鉴别：一是观察杂交菌株是否存在锁状联合；二是进行与亲本间是否存在拮抗现象的试验；三是进行酯酶同工酶试验，观察杂种与亲本的亲缘关系；四是进行出菇试验，观察杂种能否结实及子实体的生长状况。这些鉴别指标是目前食用菌育种专家的共识[5-6]。

试验选育出的金针菇杂交新菌株，在沈阳恒生农业发展有限公司的中试试验中，各项农艺性状指标（生物学效率及形态特征等）均表现较好，但在工厂化生产的长期使用中，优良性状是否具有持续性，实际效果尚需进一步的栽培验证。