调节性T细胞与非酒精性脂肪性肝病①

金 岳 胡义扬 冯 琴

(上海中医药大学附属曙光医院，上海中医临床重点实验室，肝肾疾病病证教育部重点实验室，上海201203)

非酒精性脂肪肝(Nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是指肝细胞脂质过度沉积，不伴有酒精的过量摄入，其疾病谱包括单纯非酒精性脂肪肝(Nonalcoholic fatty liver，NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(Nonalcoholic steatohepatitis，NASH)、肝纤维化、肝硬化以及NAFLD相关肝癌。NAFLD已经成为全世界常见的慢性肝病。美国约有25%的成年人患有脂肪肝，部分患者中超过25%由于血清转氨酶水平升高和缺乏其他可识别的肝损伤原因而被定义为NASH，这些NASH患者中约有1/4可进展为NASH相关肝纤维化或肝硬化[1]。“多重打击学说”是目前公认的NAFLD发病机制。来自于肝内或肝外的损伤因素，导致促炎和抗炎因素失衡，胰岛素抵抗(Insulin resistance，IR)、铁沉积、氧化应激和肝细胞损伤等参与NAFLD的发生发展。免疫系统，包括固有免疫和适应性免疫被证实是NASH的又一关键发病机理。肝脏作为重要的免疫器官，内含众多免疫细胞，包括Kupffer细胞、自然杀伤细胞(Natural killer cell，NK)、树突状细胞(Dendritic cell，DC)、肝窦内皮细胞及调节性T细胞(Regulatory T cell，Treg)，这些细胞介导了肝脏的免疫反应。同时，肝脏也是免疫损伤的靶器官，免疫系统参与肝脏的损伤、修复、纤维化等，这些免疫反应对维持和介导一系列病理过程有重要意义。近年来，Treg细胞被证实在NAFLD发病机制中发挥重要作用。本文主要将Treg细胞在NAFLD发病中的作用及相关治疗进展进行综述。

1 调节性T细胞

Treg属CD4+T辅助(T helper,Th)细胞的一种亚型，由幼稚的CD4+T细胞在抗原刺激下，被选择性激活，并在微环境影响下分化为效应性T细胞，发挥细胞免疫功能。CD4+T细胞亦可分化为Th1、Th2、Th17等细胞。Treg目前被定义为具有CD4+CD25+表面标志物并表达胞内转录因子叉头翼状螺旋转录因子(Forkhead/winged helix transcription factor 3,Foxp3)的CD4+T淋巴细胞的子集，即CD4+CD25+Foxp3+T细胞。研究者于1995年首次发现CD4+T细胞的CD25+亚类具有调节活性；从T细胞接种物中消除CD4+CD25+T细胞可增加移植物抗宿主病和受体菌株中产生的自身免疫疾病的特征。CD4+CD25+T细胞占外周血液CD4+T细胞的5%～10%，它们通过积极抑制自身反应性淋巴细胞而在维持免疫耐受中发挥重要作用。Treg的发育由Foxp3控制，属于Forkhead/Winged-helix转录因子家族的新成员，被认为是Treg细胞的特征性标志物，其表达对Treg细胞发育成熟和发挥免疫抑制功能均具有重要作用[2]。Tsuda等[3]证明人Foxp3 转基因小鼠的基因表达完全受限于 CD4+T 细胞中的Treg细胞，且证明T细胞受体(T-cell receptor，TCR)信号是 Foxp3 基因表达的条件之一，转化生长因子β(Transforming growth factor-β，TGF-β)存在时，通过TCR刺激在小鼠Treg细胞上观察到人Foxp3 表达。

Tregs在体内主要发挥免疫抑制作用[4]。免疫抑制能力表现为对T细胞增殖、分化的抑制，对抗原提呈细胞(Antigen presenting cell,APC)活性的干扰和直接介导靶细胞的死亡。此外，Tregs可通过分泌颗粒酶A和穿孔素溶解T细胞、分泌抑制性细胞因子白介素10(Inteleukin-10，IL-10)和TGF-β、产生腺苷酸等多种机制来发挥免疫抑制功能。

2 NAFLD疾病过程中Treg的变化

2.1 NAFLD或肥胖患者机体Treg变化 近年来，对于Treg细胞在NAFLD发病中的变化，不少学者进行了探讨。马巧平等[5]研究表明NAFLD患者外周血CD4+CD25+Foxp3 T细胞百分数水平低于正常人群，且随着脂肪肝程度的加重而降低；中、重度脂肪肝CD4+CD25+Foxp3+T细胞百分数水平低于轻度脂肪肝，提示血清CD4+CD25+Treg下降水平与脂肪肝程度呈正相关。谢中华等[6]研究发现，NAFLD患者外周血调节性T细胞的减少与胰岛素抵抗指数呈明显负相关，这表明调节性T细胞可能通过调节胰岛素抵抗参与NAFLD的形成和发展。内脏脂肪组织的Treg可以调节脂肪组织的炎症，使机体免受肥胖相关的代谢综合征(如NAFLD、2型糖尿病)的影响，研究发现肥胖患者内脏脂肪组织Treg下降，可能是肥胖患者易发生代谢紊乱的原因。Rau等[7]对112例肥胖相关的NAFLD患者进行临床观察发现NAFLD患者外周血和肝活检组织中Treg(CD4+CD45RA+CD25++)细胞均有不同程度的下降；但减肥手术之后Treg(CD4+CD45RA+CD25++)含量增加。然而，另一项针对不同肝脏疾病(NAFLD、自身免疫性肝炎)的研究中发现，NAFLD肝脏组织的Foxp3的表达增加，局部Treg的累积与凋亡介质的表达及肝脏的炎症相关[8]；并且肝脏组织学评分超过4分的患者与非NASH患者相比的Foxp3阳性细胞增加，即肝组织的炎症程度与Foxp3的表达呈正相关[9]。现在部分研究结果出现矛盾，需要进一步深入研究证实。

2.2 NAFLD动物模型中Treg变化 一些学者在不同的动物模型中探讨了Treg细胞在NAFLD中的变化情况。Ma等[10]研究表明，高脂饮食的小鼠在喂养到第八周时其肝脏的Treg细胞含量下降一半，而脾脏的Treg细胞没有变化，可见高脂饮食诱导的Treg细胞消耗可能是肝脏特异性的；该研究同样观察到在NASH小鼠体内，氧化应激可引起Treg细胞凋亡，肝内Treg数量逐渐减少，对炎性反应的抑制性降低，而抗氧化治疗可以减少Treg凋亡增加肝内Treg数量，减少脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)诱导的肝脏损伤。尾静脉注射磁珠分离纯化的同种系Treg细胞至小鼠体内时，同样可以改善LPS诱导的肝脏组织学损伤，降低血清谷丙转氨酶(Alanine aminotransferase，ALT)水平，推测Treg细胞可能通过抗氧化阻断NAFLD的进展[10]。此外，Treg还可以通过诱导巨噬细胞分化为抗炎的M2型巨噬细胞，分泌抗炎因子IL-10，使肝组织对胰岛素的敏感性增强，减轻胰岛素抵抗水平，改善NASH[11]。

初始T细胞在TGF-β和IL-6的共同诱导下分化为Th17细胞，而在TGF-β单独诱导下分化为Treg细胞。Treg细胞具有抗炎作用，Th17细胞发挥促炎作用，Th17细胞与Treg细胞在功能和分化过程中相互对抗，在正常情况下两者保持平衡，有利于机体免疫稳定状态的维持，若两者失衡就会产生一系列免疫病理反应。高脂饮食36周诱导的NASH小鼠研究结果显示模型小鼠肝脏和腹部脂肪Treg含量下降，Th17含量增加[12]。另外一项NAFLD相关肝癌研究发现小鼠肝脏Treg比例虽未发生明显改变但是绝对数量有所下降[13]，提示Treg可能参与NAFLD相关肝癌的发生发展。

从现有报道来看，除个别研究外，大多研究提示Treg在NAFLD患者体内或动物体内是下降的，并与NAFLD进展中的胰岛素抵抗和炎性反应相关。但目前研究主要局限在观察外周血、脂肪组织或肝脏单器官Treg的变化情况，缺乏对机体内肝脏、外周血、脂肪组织、肠道等多组织系统观察以及内在机制的探讨。

3 NAFLD发病过程中影响Treg的因素

NAFLD的发生与糖脂代谢异常、脂肪组织堆积、肠道菌群紊乱、炎症因子释放紊乱等密切相关。相关病理因素促进NAFLD发生发展同时，影响机体Treg的分化发育及功能发挥，同时Treg的异常又可能反过来进一步促进NAFLD相关代谢紊乱或免疫损伤。

3.1 共刺激分子B7和共刺激分子CD40 共刺激分子B7属于免疫球蛋白超家族，其配体为CD28，CD28/B7是激活T细胞的关键共刺激分子，可以诱导幼稚T细胞向Treg细胞分化。B7敲除小鼠进行高脂饮食诱导肥胖，其小鼠肝脏Treg大量下降，同时皮下脂肪组织和附睾脂肪组织的Treg下降，肝脏和脂肪组织的炎症因子水平增加，胰岛素信号异常，炎性反应加剧[14]。 CD28缺陷小鼠的内脏脂肪组织和肝脏的Treg数量减少，但其肝脏脂质沉积和炎症减少[15]。

CD40L为共刺激分子CD40的配体，CD40/CD40L是T细胞另外一对共刺激分子。CD40缺陷可增加内脏脂肪组织Treg含量，恶化内脏脂肪组织的炎症和胰岛素抵抗，加速肝脏的脂肪变性[16]。但CD40L敲除的高脂饮食诱导的肥胖小鼠，附睾脂肪组织和脾脏Treg细胞增加，同时肝脏脂肪变性、气球球样变和小叶炎症减轻[17]。

3.2 肝细胞乙酰辅酶A羧化酶1(Acetly CoA carboxylase 1，ACC1) ACC是脂肪从头合成过程中的限速酶，NAFLD患者体内肝脏脂肪新生明显增多，ACC活性显著升高。脂肪酸是合成内源性甘油三酯(Triglyceride，TG)的主要原料，在脂质代谢过程中起重要的作用。研究证实抑制ACC1可使初始T细胞更多地向Treg细胞分化，而在脂肪酸合成功能正常的情况下则更多地向Th17细胞亚群分化，促进炎性反应[18]。

3.3 雷帕霉素靶蛋白(mechanistic target of rapamy-cin,mTOR) 哺乳动物mTOR是介导脂质堆积的关键环节之一，与细胞的生长和代谢密切相关，其表达上调会使热量摄入增加，胰岛素敏感性下降，加速机体脂肪的合成和能量蓄积。mTOR信号通路对Treg有着重要的调控作用，mTOR缺陷或特异性敲除mTOR的小鼠CD4+T细胞趋向分化为Treg，而不能发育为效应性T细胞[19]。当机体处于高糖状态时，细胞分泌TGF-β因子激活mTOR信号通路，导致Foxp3的低表达，影响Treg的分化、增殖和抑制功能。然而，缺氧诱导因子1α(Hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)可通过mTOR通路靶向降解Foxp3蛋白酶体，抑制Treg生成而促进Th17分化，从而调节糖酵解信号通路和转录系统[20]。

3.4 瘦素 瘦素是一种主要由脂肪组织分泌的激素，参与糖、脂肪及能量代谢的调节，促进机体减少摄食，增加能量释放，抑制脂肪细胞的合成，进而使体重减轻。机体瘦素抵抗可以改变肝细胞的胰岛素信号，增加肝细胞内脂肪含量，引起肝脏脂肪变性。正常小鼠Treg细胞多聚集在内脏脂肪组织，肥胖小鼠中瘦素水平较高，且Treg数量明显少于正常小鼠[21]。De Rosa等[22]发现Treg细胞高表达瘦素和瘦素受体，瘦素可影响Treg细胞的增殖及免疫抑制功能。在瘦素缺陷(ob/ob)或瘦素受体缺陷(db/db)小鼠模型可以观察到外周血Treg细胞数量、比例以及免疫抑制功能显著提高；外源性补充瘦素后，Treg细胞的数量及比例则出现下降。

3.5 过氧物酶体增殖体激活受体-γ(Peroxisome proliferators-activated receptors，PPAR-γ) PPAR-γ是脂肪细胞分化诱导和控制多种脂肪细胞因子基因表达的一个关键转录因子，它不仅是脂肪细胞分化的主要调节因子，而且是胰岛素增敏剂，提高细胞内胰岛素受体底物活性而增加胰岛素敏感性，并且对内脏脂肪组织Treg细胞的聚集、表型和功能发挥重要的调控作用。PPAR-γ特异性地敲除，使Treg在脂肪组织的表达大量减少，PPAR-γ的激动剂(如吡格列酮、噻唑烷二酮)可以增加高脂饮食诱导的肥胖小鼠脂肪组织Treg细胞的数量，减少脂肪组织的炎症，改善肥胖相关的代谢紊乱[23]。

3.6 肠道菌群及其代谢产物 研究表明肠道菌群与NAFLD发病密切相关，近年来，肠道菌的发酵产物短链脂肪酸(Short chain acids，SCFA)被发现在多方面影响机体的免疫功能。SCFA是细菌发酵食物纤维的主要代谢产物，在肠道中浓度很高，肠腔内的SCFA能够进入黏膜固有层，与结肠黏膜固有层内Treg的G蛋白耦联受体结合，促进Treg功能[24]，亦可促进肠上皮细胞分泌TGF-β，刺激Treg分化。SCFA中的丁酸盐则通过抑制组蛋白去乙酰化酶，增强了Foxp3位点中Lys27的组蛋白乙酰化作用，由此增加Foxp3蛋白的转录并稳定表达，以此维持Treg免疫调节能力[25]。Arpaia等[25]研究发现高脂饮食诱导的NASH小鼠中，肝内和肠道Foxp3明显下降，但丁酸梭菌干预后，肠内和肝脏Treg含量增加，相关的炎症因子下降，肝脏组织学改善。

3.7 IL-21和IL-2 IL-21可由Th1、Th17、活化的NKT细胞和T滤泡辅助细胞分泌，其在诱导和维持免疫介导的慢性炎症过程中发挥重要作用，并负调节Treg分化和活性。IL-21敲除的高脂饮食肥胖小鼠，其附睾脂肪组织的Treg水平明显升高，肝脏组织大泡性脂肪变性改善，促炎的巨噬细胞减少，同时胰岛素水平改善，脂肪组织抗炎的巨噬细胞M2(Mgl2,YM1)增加[27]。Treg细胞高表达高亲和力IL-2受体，可以通过竞争性地消耗IL-2而抑制效应性T细胞的增殖和分化[28]。腹腔注射人重组细胞因子IL-2可增加肥胖小鼠体内Treg数量，减轻胰岛素抵抗。

总体来看，除了T细胞的共刺激分子如B7、CD40等的直接激活作用外，参与NAFLD发病的重要转录因子、细胞因子如PPAR-γ、瘦素等亦是调节Treg增殖、分化的重要影响因素；另外，Th17细胞、巨噬细胞等肝脏中其他的免疫细胞亦通过特定细胞因子与Treg相互制约或相互激活。总之，多种因素参与NAFLD进展中Treg的分化、发育，Treg的发育异常又反过来影响NAFLD的进展，两者互为因果、关系密切。了解NAFLD进展中各种因素对Treg细胞的作用，可为NAFLD的治疗提供新视角。

4 与调节Treg相关的NAFLD治疗

虽然目前研究对于NAFLD病理生理、诊断和自然史已经取得了一些进展，但尚无FDA批准的药物应用于治疗NAFLD。减重是一个难以实现和维持的任务，因此药物治疗相当重要。目前没有NAFLD的靶向Treg治疗药物，但是部分研究表明相关的抗体类或蛋白类药物(如CD3单克隆抗体、抗TNF融合蛋白、抗LPS抗体)可以通过调节Treg来发挥对NAFLD的保护作用。

CD3分子是T细胞膜上的重要分化抗原，是成熟T细胞的特征性标志；利用抗CD3单克隆抗体可激发或阻断T细胞活化信号转导，清除效应T细胞或诱导调节T细胞的产生。虽然CD3单克隆抗体主要用于器官移植或自身免疫性疾病的治疗，但是也有部分研究探讨了CD3单克隆抗体对NASH或糖尿病的治疗，并且取得了不错的效果。在ob/ob小鼠模型中，给予小鼠抗CD3单克隆抗体，可以改善肝脏脂肪堆积、降低胰腺增生和肌肉炎症；降低血清ALT、谷草转氨酶(Aspartate aminotransferase，AST)活性，以及胆固醇和TG水平；这些效应与促进Treg产生以及IL-10、TGF-β水平的增加相关[29]。相关的临床研究证实口服CD3单克隆抗体能够诱导Treg细胞的产生，抑制NASH患者的炎症状态，改善NASH临床指标[30]。在健康志愿者的Ⅰ期临床试验中，口服给予抗CD3单克隆抗体，剂量范围为每日0.2至5.0 mg，其外周血中CD4+CD25+调节性T细胞数量增加，Th1/Th17和IFN-γ应答受到抑制[31]；在NASH的Ⅱ期临床研究中，口服不同剂量的抗CD3制剂，可促进外周Treg细胞产生，改善胰岛素抵抗，并且血浆葡萄糖和肝酶的降低具有剂量依赖性[32]。这些数据均支持口服抗CD3单克隆抗体可诱导免疫抑制，增加外周血中CD4+CD25+调节性细胞从而减轻与NASH相关的肝损伤。

PRX-106不可吸收，为可溶性人TNF受体(TNFR)组成的重组抗TNF融合蛋白。在体外，TNFR与TNF-α结合，抑制其与细胞TNFR的结合，从而阻断其下游效应。NASH小鼠灌胃PRX-106 22周，观察到小鼠肝脏TG含量降低，同时血清TG，AST、葡萄糖水平改善，脾脏和肝内Treg淋巴细胞比例增加[33]。在Ⅰ/ⅡA期临床试验中，健康志愿者连续14 d口服3种不同剂量(2，8或16 mg/d)的PRX-106，其在8 mg处理组的外周血中Treg显著增加[34]。

Imm124E是抗LPS抗体。口服不可吸收的Im124E免疫制剂通过改善免疫进而缓解NASH。在NASH和糖尿病的ob/ob小鼠模型中，口服Imm124E降低血清ALT活性、肝脏TG含量，改善葡萄糖耐量，这些作用与增加的脾脏Treg细胞，减少的血清TNF-α水平相关[35]。在一项开放标签的临床试验中，经活检证实为NASH和2型糖尿病患者口服给予Imm124E 30 d，其外周血中Treg升高，胰岛素抵抗减轻、血清TG、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇和肝酶水平降低，胰升血糖素样肽-1和脂联素水平升高[36]。Imm124E免疫制剂用于治疗NASH患者的全球性的大型双盲、加倍剂量、随机、安慰剂对照试验正在进行(Clinical Trial Gov.NCT02 316717)。

5 总结与展望

近些年，随着对免疫及代谢认识的不断深入，“免疫代谢”的概念被提出并成为关注热点。天然或获得性免疫系统参与了既往所认为的非免疫性疾病，如肥胖，产生代谢与免疫方面的异常。NAFLD是肥胖相关的代谢性疾病，肝脏以及全身的免疫异常被发现是单纯脂肪肝向NASH和肝纤维化进展的重要参与因素。T细胞是特异性免疫中细胞免疫的执行细胞，其中Treg细胞主要发挥免疫抑制及免疫耐受功能。本文立足于Treg细胞，对NAFLD疾病过程中Treg的变化、影响Treg分化发育的因素以及目前报道与调节Treg相关的治疗等进行了综述。

从现有报道来看，大多研究提示作为一种具有抑制炎症功能的免疫细胞，Treg在NAFLD患者及模型动物体内是下降的，但亦有相反的报道，有待更多研究去探索或证实。

几项涉及以Treg细胞为间接靶点进行的临床及基础研究证实相关药物可以通过影响Treg改善NAFLD的胰岛素抵抗以及炎症状态，肯定了以Treg为靶点的相关免疫治疗在NAFLD中的可行性及有效性。这不仅能为免疫系统与NAFLD的交互作用提供新的理解，也为NAFLD的治疗提供新思路。

除Treg外，肝脏中定居着库普弗细胞、NK、NKT等非特异性免疫细胞及B细胞、Th1、Th2、Th17等其他效应性淋巴细胞，构成了NAFLD复杂的免疫微环境。Treg被认为可能是阻断单纯性脂肪肝转变为脂肪性肝炎的最后一道“防线”，其与其他免疫细胞协同产生的免疫应答加速或放大了损伤，但同时也参与了NASH炎症及纤维化的缓解。NASH为疾病进展的中间阶段，全局把握NASH的免疫病理，免疫与炎症、胰岛素抵抗等的关系以及不同免疫细胞在NASH的作用、角色及相互关系是治疗NAFLD的关键所在。