高效液相色谱-串联质谱法定量分析橄榄果实氨基酸组分

彭真汾，王 威，叶清华，陈清西*

（福建农林大学园艺学院，福建 福州 350002）

氨基酸具有抗菌[1]、保肝保肾[2]、降血脂[3]等作用，可分为水解氨基酸和游离氨基酸，其中水解氨基酸以结合态形式存在于肽和蛋白质中，主要体现物质的营养状况[4-5]；游离氨基酸以游离态存在，一方面可通过呈味氨基酸反映物质口感和风味，以及药用氨基酸反映药用价值[4,6-7]；另一方面，通过其在逆境中游离氨基酸含量特别是脯氨酸含量反映植物抗逆性强弱[8]。因此，食物氨基酸含量、种类和比例是评价其营养价值优劣的主要指标之一，是对其营养品质和风味均有重要贡献的成分[9]。

橄榄（Canarium album（Lour.）Raeusch.）为橄榄科（Burseraceae）橄榄属（Canarium）植物，又名青果、青榄、白榄，属热带、亚热带果树[10]，是福建省名特优水果，果实营养价值高，富含VC和钙质[11-12]，同时具有很高的药用价值，能达到生津止渴[10]、解酒保肝[13]等功效，是一种药食两用的水果[16]。目前，橄榄氨基酸的研究多集中于成熟时期果实水解氨基酸的变化[11,14-16]，对其成熟过程氨基酸含量变化及游离氨基酸的研究较少。用于测定氨基酸含量的常见方法有分光光度计法[17]、氨基酸自动分析仪法[18]和液相色谱法[19-21]等。分光光度法操作简单方便，但其只能测定某种氨基酸或一类氨基酸，不能进行氨基酸分离[17]；氨基酸自动分析仪是一种专门测定氨基酸含量的仪器，能同时测定多种氨基酸，但其价格昂贵、用途单一且需对氨基酸进行柱后衍生，存在一定局限性；液相色谱法包括柱前、柱后衍生法和直接测定法，3 种方法均能对氨基酸进行分离测定，但柱前和柱后衍生法会对检测结果产生一定影响，因此直接法具有一定的优势，其中液相色谱-串联质谱是直接法中的一种[22]。故本研究选择普通橄榄‘长营’和清橄榄‘清榄1号’2 个不同风味的橄榄品种，通过高效液相色谱-串联质谱法测定其成熟过程水解氨基酸和游离氨基酸组分与含量，从氨基酸组分方面分析其对2 个橄榄品种营养品质和风味的贡献，为今后鲜食橄榄品种选育与果实品质调控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

‘长营’、‘清榄1号’橄榄果实采于福建省闽清县久源橄榄专业合作社，于花后30 d开始采摘，每20 d采摘一次，共9 次。

乙腈、甲酸、甲醇（均为色谱级） 德国Merck公司；乙酸铵（色谱级）、20 种氨基酸标准品：甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）、丝氨酸（Ser）、脯氨酸（Pro）、缬氨酸（Val）、苏氨酸（Thr）、半胱氨酸（Cys）、亮氨酸（Leu）、异亮氨酸（Ile）、天冬酰胺（Asn）、天冬氨酸（Asp）、谷氨酰胺（Gln）、赖氨酸（Lys）、谷氨酸（Glu）、甲硫氨酸（Met）、组氨酸（His）、苯丙氨酸（Phe）、精氨酸（Arg）、酪氨酸（Tyr）、色氨酸（Trp） 美国Sigma公司；0.22 μm型尼龙、聚醚砜一次性过滤器 天津津腾实验设备有限公司；盐酸、无水乙醇均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

Xevo TQ-S高效液相色谱-串联质谱联用仪 美国Waters公司；LGJ-25C型冷冻干燥机 北京四环科学仪器厂有限公司；FW177型中草药粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司；KQ-300DE型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；Allegra 64R型台式高速冷冻离心机美国贝克曼库尔特公司；DK-S22型电热恒温水浴锅、DHG-9240A型恒热恒温鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限公司；MNT-2800D型氮吹仪 天津奥特赛恩斯有限公司；RV10型旋转蒸发仪 德国IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液的制备

先将每个氨基酸标准品用甲醇溶液配制成不同浓度储备液。吸取一定体积储备液，用70%甲醇溶液定容至10 mL，配为混标液。再吸取混标液100、200、500 μL和800 μL，用70%甲醇溶液分别定容至1 000 μL，得到4 个浓度标准溶液，分别稀释10、100、1 000 倍，共获得17 个不同浓度标准溶液。

1.3.2 橄榄粉末的制备

将新鲜采下的橄榄用4 ℃保温箱带回实验室，立即洗净、晾干、取果肉，冻干并粉碎至过40 目筛后保存于－40 ℃冰箱。

1.3.3 橄榄果实水解氨基酸样品的提取

参考GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸含量的测定》[23]并略有改进。称取橄榄粉末0.25 g（精确至0.000 1 g）于水解管中，加入5 mL 6 mol/L HCl溶液，充分浸透粉末，避免黏壁，用氮吹仪充氮气10 min后瓶塞封口，置于110 ℃烘箱中水解24 h，冷却，过滤，吸取1 mL上清液用蒸馏水稀释5 倍，吸取稀释液3 mL置于水浴锅上反复蒸干8 次（每次用2 mL蒸馏水），用2 mL蒸馏水冲洗干样后过0.22 μm聚醚砜过滤器作为橄榄果实水解氨基酸样品。

1.3.4 橄榄果实游离氨基酸样品的提取

称取橄榄粉末0.5 g（精确至0.000 1 g）于50 mL离心管中，加入60%乙醇溶液20.5 mL，在超声功率270 W、超声温度50 ℃条件下超声提取20 min，后在常温下10 000 r/min离心10 min，过0.22 μm尼龙过滤器作为橄榄果实游离氨基酸样品。

1.3.5 色谱条件

色谱柱：Merck ZIC-pHILIC（100 mm×2.1 mm，5 μm）；柱温：40 ℃；流速：0.4 mL/min；进样室温度：10 ℃；进样量：2 μL；流动相A：5 mmol/L乙酸铵溶液；流动相B：0.1%甲酸-乙腈溶液；梯度洗脱程序：0～13 min 5% A，13～15 min 5%～60% A，15～20 min 60%～5% A。

1.3.6 质谱条件

表1 20 种氨基酸的质谱条件Table 1 Mass spectrometric conditions for 20 amino acids

离子源：电喷雾正离子模式；监测方式：多反应监测；离子源温度：150 ℃；毛细管电压：1.00 kV；锥孔电压：30 V；锥孔气（N2）流量：150 L/h；脱溶剂气（N2）流量：800 L/h；脱溶剂温度：400 ℃；碰撞气（Ar）流速：0.13 mL/min；定量方式：外标法。其他质谱条件如表1所示。

1.3.7 氨基酸评价指标的计算[24-26]

氨基酸比值（ratio of amino acid，RAA）、氨基酸比值系数（ratio coefficient，RC）、氨基酸比值系数分（score of ratio coefficient，SRC）、含量阈值比（ratio of content and taste threshold，RCT）分别按公式（1）～（4）计算：

式中：SRD为RC相对标准偏差； 为氨基酸RAA的平均值。

1.4 数据处理

数据整理和图表制作采用Excel 2013软件，显著性分析采用SPSS 17.0软件，仪器控制、数据采集软件为Masslynx V4.1 SCN905；数据处理软件（即积分和定量）采用Masslynx中的Targetlynx模式。

2 结果与分析

2.1 氨基酸的线性关系、检测限和定量限

表2 20 种氨基酸的标准曲线方程Table 2 Standard curves and limits of detection and quantification for 20 amino acids

通过配制不同浓度标准品进行20 种氨基酸标准曲线的制作，由表2可知，20 种氨基酸标准曲线线性关系良好，相关系数均达到0.97以上。以各氨基酸色谱峰3 倍以及10 倍信噪比分别得出检测限和定量限，并以定量限线性最高质量浓度确定其线性范围。

2.2 橄榄果实水解氨基酸组分与含量

2.2.1 橄榄果实各发育时期水解氨基酸含量和组成

通过高效液相色谱-串联质谱法测定‘长营’与‘清榄1号’果实从花后30～190 d水解氨基酸组成与含量变化。从表3可知，‘长营’与‘清榄1号’均检测出16 种氨基酸，其中包括7 种必需氨基酸：赖氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸；9 种非必需氨基酸：甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、精氨酸和酪氨酸。由于本实验提取水解氨基酸时采用酸水解法，因此色氨酸可能在提取过程中被破坏未检测出来[27]，半胱氨酸含量低于检测限而未被检测出来。总体上，‘长营’和‘清榄1号’果实含量较高的氨基酸为天冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、亮氨酸和赖氨酸。

由表3可知，‘长营’水解氨基酸总量（total amino acid，TAA）最高在花后50 d为16.590 6 mg/g，与花后70 d（16.073 5 mg/g）和花后190 d（15.761 9 mg/g）含量无显著性差异（P＞0.05）；最低在花后110 d为11.673 9 mg/g，与最高值差异显著（P＜0.05），整体趋势为升-降-升，变化较平缓。必需氨基酸（essential amino acid，EAA）含量各时期变化不大，最高在花后50 d为6.105 5 mg/g，最低是花后110 d为4.124 2 mg/g。必需氨基酸与总氨基酸含量比值（EAA/TAA）为30.202 7%～40.676 0%，与40%较为接近，必需氨基酸与非必需氨基酸（non-essential aminoacid，NEAA）比值（EAA/NEAA）为43.272 0%～68.565 8%，与60%相比相近，各时期两个比值表现为随着发育时间的延长，比值与标准差值越来越大，其中以花后30 d与50 d最为接近，达到联合国粮农及农业组织/世界卫生组织（FAO/WHO）推荐的理想蛋白质标准[28]，表明‘长营’橄榄随着发育逐渐转变为营养不均衡类型。

由表3可知，‘清榄1号’水解TAA最高是花后190 d，为22.187 3 mg/g，显著高于其他时期（P＜0.05），最低在花后70 d，为8.759 8 mg/g。整体呈上升趋势，变幅较大。EAA含量各时期变化不大，最高是花后190 d，为5.646 2 mg/g，最低在花后70 d，为3.548 1 mg/g。EAA/TAA为25.447 9%～40.504 3%，高低差异大，仅花后30、50 d与70 d与40%相近，EAA/NEAA为34.134 6%～68.0795%，变幅大，仅花后30、50 d与70 d与60%接近，其中以花后30、50 d和70 d与FAO/WHO推荐的理想蛋白质标准[28]最为接近，花后190 d相差最大，表明‘清榄1号’橄榄随着发育逐渐转变为营养不均衡类型。

因此，‘长营’与‘清榄1号’果实水解氨基酸含量随着发育离FAO/WHO推荐的理想蛋白质标准越来越远，表现为营养价值不均衡。以鲜食为主的成熟果花后190 d相比较，‘清榄1号’水解TAA和EAA含量均高于‘长营’，但其EAA/TAA与EAA/NEAA比值均低于‘长营’。

表3 ‘长营’和‘清榄1号’果实不同发育时期水解氨基酸组成与含量Table 3 Hydrolytic amino acid composition of ‘Changying’ and ‘Qinglan 1 hao’ olives at different developmental stages

2.2.2 EAA与FAO/WHO推荐的氨基酸模式谱的比较

表4 ‘长营’和‘清榄1号’果实不同时期EAA与FAO/WHO推荐氨基酸模式谱比较Table 4 Comparison between essential amino acid composition of‘Changying’ and ‘Qinglan 1 hao’ olives at different developmental stages and FAO/WHO recommended patterns

从表4可知，‘长营’和‘清榄1号’各时期的EAA/TAA与FAO/WHO推荐的氨基酸模式谱[27]相比，除甲硫氨酸与半胱氨酸含量远低于模式谱标准值，缬氨酸含量略低于模式谱标准值，其余氨基酸均与模式谱推荐值相当，或高于模式谱，其中有一个原因可能是由未检测出半胱氨酸引起。营养学上把食物中各EAA/TAA与氨基酸模式谱标准值相当的认为是营养价值高且均衡的食物，而那些低于氨基酸模式谱的EAA即未达到人体需求比例的EAA称为限制氨基酸，并根据其不足差异大小，分为第1限制氨基酸和第2限制氨基酸等[29]。依此，‘长营’和‘清榄1号’各时期的EAA组成和含量均与氨基酸模式谱标准值有一定的差距，营养价值不够均衡，但属于人体第1限制氨基酸——赖氨酸含量较高的食物。

2.2.3 SRC法对橄榄果实各发育时期蛋白质营养价值的评价

RAA及RC越接近1，则表明其EAA含量越接近FAO/WHO推荐值[27]。从表5可知，‘长营’和‘清榄1号’除甲硫氨酸+半胱氨酸RAA和RC值远低于1，缬氨酸略低于1，其余RAA均接近1。因此，甲硫氨酸和半胱氨酸为‘长营’与‘清榄1号’的第1限制氨基酸。SRC值越接近100，食物中各EAA含量越均衡，营养价值越高[27]。‘长营’与‘清榄1号’SRC值不高，除花后170 d外，其余时期SRC均低于60，表明2 种橄榄果实EAA含量不均衡，导致营养价值不足。此结果与氨基酸模式谱的比较结果相当。

表5 ‘长营’和‘清榄1号’不同发育时期必需氨基酸的RAA、RC和SRCTable 5 RAA, RC and SRC of essential amino acids in ‘Changying’ and‘Qinglan 1 hao’ olives at different developmental stages

2.3 橄榄果实游离氨基酸组分与含量

2.3.1 橄榄果实各发育时期游离氨基酸含量和组成

氨基酸具有呈味性[4,30-33]，可分为甜味氨基酸：甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸、组氨酸和谷氨酰胺；苦味氨基酸：缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、色氨酸和精氨酸；鲜味氨基酸：赖氨酸、谷氨酸、天冬氨酸和天冬酰胺；芳香族氨基酸：苯丙氨酸、酪氨酸和半胱氨酸。据其是否有药用价值，归为药用氨基酸：甘氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸[34]。

从表6可知，通过高效液相色谱-串联质谱法测出‘长营’和‘清榄1号’果实各时期均含有19 种氨基酸，其中仅半胱氨酸因含量低于检测限未测出。‘长营’果实游离氨基酸含量总体呈升-降-升-降趋势，含量最高在花后150 d为10.146 0 mg/g，与花后50 d（10.076 8 mg/g）无显著性差异（P＞0.05），其他时期含量具有显著性差异（P＜0.05），最低为花后30 d仅6.493 2 mg/g；呈味氨基酸在花后150 d前以甜味氨基酸含量居高，之后以鲜味氨基酸为主，苦味氨基酸含量降低，芳香族氨基酸略有减少，药用氨基酸总体在增加。‘清榄1号’果实游离氨基酸含量总体呈降-升-降-升趋势，含量最高在花后190 d为14.542 6 mg/g，与其他时期含量形成显著性差异（P＜0.05），最低为花后70 d仅5.080 4 mg/g；呈味氨基酸在花后150 d前以甜味氨基酸含量居高，后以鲜味氨基酸为主，苦味氨基酸总体上稍有增加，芳香族氨基酸有所减少，药用氨基酸总体呈上升趋势。

表6 ‘长营’和‘清榄1号’果实不同发育时期游离氨基酸组分与含量Table 6 Free amino acid composition of ‘Changying’ and ‘Qinglan 1 hao’ olives at different developmental stages

‘长营’与‘清榄1号’果实游离氨基酸总量趋势有所差异。两者含量较多的氨基酸均为丝氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、天冬氨酸和天冬酰胺。呈味氨基酸均表现出前期甜味氨基酸占比大，后期鲜味氨基酸为主，苦味氨基酸总体变化不大，芳香族氨基酸先增加后逐渐减少，药用氨基酸含量逐渐增大。以鲜食为主的花后190 d相比，‘清榄1号’果实游离氨基酸含量较‘长营’高出7.137 7 mg/g，‘清榄1号’果实游离氨基酸总量上更具有优势。

2.3.2 橄榄果实不同时期游离氨基酸RCT值

每个氨基酸都有其味觉阈值[4,30-33]，通过其RCT决定其对食物风味的贡献，并非含量越高其贡献就越大，当RCT大于1时，此氨基酸对食物具有贡献，并且RCT值越大，贡献就越大，否则就对食物风味无贡献[4]。从表7可知，对‘长营’和‘清榄1号’果实风味贡献较大的有苦味的精氨酸以及呈鲜味的谷氨酸、天冬氨酸和天冬酰胺。使‘长营’和‘清榄1号’橄榄具有丰富且独特口感。其中呈鲜味的谷氨酸和天冬氨酸均随着果实成熟，含量逐渐上升，贡献越来越大，使‘长营’和‘清榄1号’果实鲜味浓郁。以食用为主的花后190 d相比，‘清榄1号’橄榄果实鲜味和甜味贡献大于‘长营’，使‘清榄1号’橄榄更具有鲜甜味，这也许就是造成清橄榄‘清榄1号’鲜食口感优于普通橄榄‘长营’的原因之一。

3 讨论与结论

橄榄果实氨基酸种类丰富，本实验中2 个品种橄榄水解氨基酸均测出16 种氨基酸，包括7 种EAA和9 种NEAA，此结果与文献[11,14,16]测定结果相一致。在EAA含量上，赖氨酸含量高，甲硫氨酸为限制氨基酸，与林玉芳[11]、何志勇[16]结果一致，但其EAA/TAA、EAA/NEAA、EAA与氨基酸模式谱标准及氨基酸评价指标不符合理想参考值，是一种营养不够均衡的水果，与何志勇[16]认为的檀香橄榄符合FAO/WHO推荐EAA/TAA及EAA/NEAA比例接近40%和60%结果相左，可能是橄榄品种差异所导致。

表7 ‘长营’和‘清榄1号’不同时期游离氨基酸RCT值Table 7 RCT values of free amino acids of ‘Changying’ and ‘Qinglan 1 hao’ olives at different developmental stages

果实游离氨基酸中呈味氨基酸含量的差异将影响其风味品质。鲁敏等[5]通过测定无籽刺梨和刺梨中游离氨基酸含量，发现刺梨中精氨酸、谷氨酸、天冬氨酸和鸟氨酸均对刺梨果实风味形成有贡献，而无籽刺梨仅天冬氨酸为其鲜味形成作出贡献，风味品质不如刺梨丰富；岳冬等[26]测定樱桃番茄和普通番茄游离氨基酸含量，发现樱桃番茄鲜味、甜味和芳香族氨基酸含量高于普通番茄，表明樱桃番茄风味品质优于普通番茄。普通橄榄口味酸涩，多用于加工，鲜食口感不佳；清橄榄口味清淡，回甘良好，品质优于普通橄榄，更适宜鲜食。本实验表明普通橄榄‘长营’和清橄榄‘清榄1号’2 个品种橄榄鲜食品质有所差异，‘清榄1号’果实鲜、甜味氨基酸贡献高于‘长营’，表明‘清榄1号’果实鲜甜风味优于‘长营’，符合人们对2 种橄榄口感的评价。

普通橄榄‘长营’及清橄榄‘清榄1号’果实水解氨基酸在花后30～190 d均含有16 种氨基酸，包括7种EAA和9 种NEAA，赖氨酸含量高，EAA/TAA、EAA/NEAA比例不符合FAO/WHO推荐值，RAA、RC及SRC值不理想，为氨基酸种类丰富但营养价值不够均衡的高赖氨酸含量水果。

2 个品种橄榄游离氨基酸均含有19 种氨基酸，前期甜味氨基酸含量高，后期鲜味氨基酸含量高，苦味和芳香族氨基酸略有变化，药用氨基酸逐渐增高，使各时期表现出不同的风味特点和高药用价值。总体表现为清橄榄‘清榄1号’鲜味（谷氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺）、甜味氨基酸（谷氨酰胺）贡献高于普通橄榄‘长营’，风味品质优于‘长营’。