不同林型、产地、参龄及坡向对林下参20 种单体皂苷含量的影响

阮晓佳，郜玉钢*，赵 岩，臧 埔，何忠梅，祝洪艳，王立岩，张连学

（吉林农业大学中药材学院，吉林 长春 130118）

人参（Panax ginseng C.A. Mey.）是五加科人参属植物人参的干燥根，主要包括林下参、园参、农田参3 种栽培类型[1-2]，人参是百草之王，具有多种药理作用[3-4]。近年来随着人们生活水平的提高和保健意识的增强，人参的需求量不断增加，特别是林下参更是供不应求，但由于国家天宝工程的实施，伐林栽参已被明令禁止，导致园参的栽培数量急剧下降[5]。除农田栽参外，主要发展林下参种植以解决供求矛盾，但农田栽参技术尚未完全成熟，林下参种植面积迅速增加[6]。生态环境是影响林下参质量的主要条件，对人参药效成分的含量与生长发育具有重要的作用。将环境因子控制在最适宜的范围内，能够有效提高人参的品质，为人参生产条件的改善提供理论依据，从而使人参资源得到更加合理的开发与利用[7]。

人参皂苷是人参主要活性成分，人参皂苷种类和含量是评价人参质量的重要指标，找到其影响因素至关重要。目前，生态环境与人参质量之间的关系已成为研究热点[8-9]。现已有报道，产地、参龄、海拔、光照及土壤等因素均会对人参皂苷含量有一定程度的影响[10-13]。但这些研究多集中在园参上，且评价产地范围较小和皂苷种类较少。林下参在何地种植、何种环境下种植、何时进行采收才能质量最佳尚无定论，特别是林型结构对林下参质量的影响鲜见报道。因此通过不同林型、产地、参龄及坡向对林下参20 种单体皂苷含量影响的研究，不仅对林下参的采收和质量标准制定具有重要的实践价值，还能够为退耕还林时种植何种树种及其环境条件的选择提供理论指导，从而提升林下参皂苷含量与药用价值，也为林下参资源可持续开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

供试林下参分别采集于吉林省的榆林镇、靖宇县、抚松县，辽宁省的桓仁县、新宾县和黑龙江省的双鸭山市的不同坡向的樟子松林、阔叶松林、落叶松林以及针阔混交林下，经吉林农业大学中药材学院郜玉钢教授鉴定分别为5、10 a和15 a林下参。

对照品人参皂苷Rg1、Re、Rg2、Rg3、Rg5、Rf、F1、F2、Rc、Rd、Rb1、Rb2、Rb3、Rh2、Compound K、20(R)Rh1、Rk3、Rh4、原人参二醇及原人参三醇质量分数均在98%以上，批号分别为201511、201523、201545、201506、201524、201537、201549、201521、201536、201579、201501、201551、201518、201543、201520、201515、201562、201571、201519、201513 吉林大学天然药物化学实验室；甲醇、乙腈（均为色谱纯） 美国Fisher Scientific公司；纯净水杭州娃哈哈公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

LC-2010A高效液相色谱仪（配有LC-2010A型液相色谱泵、LC-2010A型自动进样器、CLASS-VP色谱工作站）、AUY220电子分析天平 日本岛津公司；KQ-250DV超声波清洗器 昆山舒美超声仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 实验设计与样品溶液制备

林型、产地、参龄及坡向对林下参皂苷影响均采用单因素试验设计，4 种林型组林下参分别采集于吉林省靖宇县阴坡下樟子松林、阔叶林、落叶松林以及针阔混交林的15 a生林下参，每组9 株；6 个产地组林下参分别采集于吉林省的榆林镇、靖宇县、抚松县，辽宁省的桓仁县、新宾县和黑龙江省双鸭山市的针阔混交林阴坡下10 a生林下参，每组9 株；3 种参龄组林下参分别采集于吉林省靖宇县针阔混交林阴坡下的5、10 a和15 a生林下参，每组9 株；3 种坡向组林下参分别采集于吉林省靖宇县针阔混交林的阳坡、平坡、阴坡下10 a生林下参，每组9 株；样品均为随机采集，均在9—10月相同时间进行。将每组林下参样品均置于通风处阴干后，单株粉碎成粒度为40 目粉末，单株混匀后，再分别精密称取其粉末0.5 g；各样品分别置于10 mL离心管中，向其中分别加入5.0 mL色谱甲醇溶液，密封，称质量，超声提取45 min，静置过夜，补足质量，再进行超声45 min，5 000 r/min离心15 min，取上清液过0.45 μm滤膜，备用。

1.3.2 高效液相色谱测定20 种人参皂苷

色谱条件参照本实验室建立的高效液相色谱同时测定20 种人参皂苷的方法[14]。C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温35 ℃；检测波长203 nm；流动相A为乙腈，流动相B为水；梯度洗脱：0～40 min，18%～21% A；40～42 min，21%～26% A；42～46 min，26%～32% A；46～66 min，32%～33.8% A；66～71 min，33.8%～38% A；71～77.7 min，38%～49.08% A；77.7～78 min，49.08%～49.1% A；78～82 min，49.1% A；82～83 min，49.1%～50.6% A；83～88 min，50.6%～59.6% A；88～89.8 min，59.6%～64.96% A；89.8～92 min，64.96%～65% A；92～97 min，65% A；97～102 min，65%～85% A；102～109 min，85% A；109～111 min，85%～18% A；流速1.0 mL/min；进样量20 μL。

1.4 数据处理

所得数据应用SPSS 19.0软件进行统计分析，以±s表示。

2 结果与分析

2.1 20 种人参单体皂苷对照品测定结果

2.1.1 色谱峰归属

图1 混合标准品色谱图Fig. 1 HPLC chromatograms of mixed standard solution

如图1所示，20 种人参皂苷单体均得到良好分离。

2.1.2 线性关系考察结果

表1 人参皂苷的回归方程Table 1 Regression equations with correlation coefficients for ginsenosides

对进样中人参皂苷质量（Y）对峰面积积分值（X）作图，得到线性回归方程，如表1所示。20 种人参皂苷单体Rg1、Re、Rf、Rb1、Rg2、Rc、Rh1、Rb2、Rb3、F1、Rd、Rk3、F2、Rh4、Rg3、原人参三醇、Compound K、Rg5、Rh2、原人参二醇在1.96～20.80 μg范围内呈良好的线性关系（r＞0.999，n=6）。

2.2 不同林型林下参皂苷含量变化

图2 林型对林下参皂苷含量影响色谱图Fig. 2 HPLC chromatograms showing the effects of different forest types on contents of ginsenosides in ginseng roots

不同林型林下参均含有14 种人参皂苷单体，如图2、表2所示。Rg1、Rf含量及20 种单体皂苷加和值樟子松林组显著高于其他3 种林型（P＜0.05）；Re、Rb2、Rb3含量樟子松林组显著高于落叶松林组与阔叶林组（P＜0.05），针阔混交林组与其余各组间差异均不显著（P＞0.05）；Rb1含量樟子松林组显著高于其他3 种林型（P＜0.05），针阔混交林组、阔叶林组显著高于落叶松林组（P＜0.05）；Rg2含量落叶松林组显著高于其他3 种林型（P＜0.05）；Rd含量针阔混交林组、樟子松林组显著高于其他2 组（P＜0.05）；Rh4含量落叶松林组显著高于针阔混交林组（P＜0.05），阔叶林组、樟子松林组与各组间差异均不显著（P＞0.05）；人参皂苷Rg5含量樟子松林组、阔叶松林组显著高于其他2 组（P＜0.05）。可见，樟子松林型下林下参中多种皂苷含量较高，在实际栽培与应用中，应优先选择在樟子松林种植林下参。

表2 林型对林下参皂苷含量的影响Table 2 Effects of different forest types on contents of ginsenosides in ginseng roots %

2.3 不同产地林下参皂苷含量变化

图3 产地对林下参皂苷含量影响色谱图Fig. 3 HPLC chromatograms showing the effects of different producing areas on contents of ginsenosidet in in ginseng roots

不同产地林下参均含有14 种人参皂苷单体，如图3、表3所示。Rg1含量抚松县露水河镇显著高于靖宇县燕平乡、新宾县倒木沟村、榆林镇白兴村、桓仁县大东沟村（P＜0.05），黑龙江双鸭山与其余各组间差异不显著（P＞0.05）；Rf含量抚松县露水河镇显著高于靖宇县燕平乡、新宾县倒木沟村与榆林镇白兴村（P＜0.05），黑龙江双鸭山显著高于榆林镇白兴村（P＜0.05），桓仁县大东沟村与各组间均无显著性差异（P＞0.05）；Rh4含量新宾县倒木沟村、榆林镇白兴村、桓仁县大东沟村显著高于抚松县露水河镇（P＜0.05），黑龙江双鸭山、靖宇县燕平乡与各组间均无显著性差异（P＞0.05）；原人参二醇含量新宾县倒木沟村、榆林镇白兴村、桓仁县大东沟村显著高于其他3 个产地（P＜0.05）。20 种人参单体皂苷加和值及其他单体皂苷均无显著性差异（P＞0.05）。可见，抚松县露水河镇皂苷含量较高，可根据实际情况对林下参的种植地域进行选择。

表3 产地对林下参皂苷含量的影响Table 3 Effects of different producing areas on contents of ginsenosides in ginseng roots %

2.4 不同参龄林下参皂苷含量变化

不同参龄林下参均含有14 种人参皂苷单体，如图4、表4所示。Rg1含量15、10 a生显著高于5 a生（P＜0.05）；Rf含量15 a生显著高于5 a生（P＜0.05），10 a生与各组间差异不显著（P＞0.05）；Rb1含量15 a生显著高于10、5 a生（P＜0.05）；而Compound K含量5 a生均显著高于10、15 a生（P＜0.05）；原人参二醇含量5 a生显著高于15 a生，10 a生与各组间均不显著。但20 种人参皂苷单体加和值及其他各单体皂苷均无显著性差异（P＞0.05）。可见，以人参皂苷含量为依据，15、10、5 a生林下参皂苷含量均符合药典规定，可以采收应用，仅取单体皂苷原人参二醇、Compound K以5 a生进行采收最佳。

图4 参龄对林下参皂苷含量影响色谱图Fig. 4 HPLC chromatograms showing the effects of different ages on contents of ginsenosidet in ginseng roots

表4 参龄对林下参皂苷含量的影响Table 4 Effects of different ages on contents of ginsenosides in ginseng roots %

2.5 不同坡向林下参皂苷含量变化

不同坡向林下参均含有14 种人参皂苷皂苷单体，如图5、表5所示。Rb2含量阳坡显著高于平坡与阴坡（P＜0.05），而阴坡显著高于平坡（P＜0.05）；Rb3含量阳坡与阴坡显著高于平坡（P＜0.05）；Rh2含量阴坡显著高于阳坡（P＜0.05），但与平坡并无显著性差异；20 种人参单体皂苷加和值及其他单体均无显著性差异（P＞0.05）。可见，坡向对3 种皂苷单体含量有显著影响，可根据实际需求对林下参栽培坡向进行选择。

图5 坡向对林下参皂苷含量影响色谱图Fig. 5 HPLC chromatograms showing the effects of different slope orientations on contents of ginsenosidet in ginseng roots

表5 坡向对林下参皂苷含量的影响Table 5 Effects of different slope orientations on contents of ginsenosides in ginseng roots %

2.6 林下参皂苷含量变化影响因素的主成分分析

表6 林下参皂苷含量变化因素的主成分分析Table 6 Principal component analysis of causative factors for changes in ginsenosides contents in ginseng roots

表7 各指标主成分的特征向量Table 7 Eigenvectors of principal components

根据特征值可确定主成分，见表6。第1主成分的特征值是3.962 7，贡献率已达99.068 6%。即第1主成分可代表林下参皂苷含量变化影响因素99.068 6%的信息含量。林型、产地、参龄以及坡向在第1主成分上均有较高的负荷，如表7所示，说明林型、产地、参龄以及坡向均是影响林下参皂苷含量变化的特征因素。

2.7 林下参特征皂苷的主成分分析

表8 林下参皂苷评价标准的主成分分析Table 8 Principal component analysis of ginsenosides for quality criteria of ginseng roots

表9 各指标主成分的特征向量Table 9 Eigenvectors of principal components

根据特征值可确定主成分个数，见表8。第1主成分的特征值是11.335 4，累计贡献率为75.569 4%，第2主分的特征值是2.765 2，累计贡献率已达94.004 3%。即2 个主成分可代表林下参皂苷94.004 3%的信息含量。Re、Rc、Rb2、Rb3、Rd、Rg5、原人参二醇以及总皂苷加和值在第1主成分上有较高的负荷，而Rg1、Rb1、Rh4在第2主成分上有较高的负荷，如表9所示。说明10 种单体皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd、Rh4、Rg5、原人参二醇以及总皂苷加和值等元素均是评价林下参质量的特征皂苷。

3 讨 论

人参具有抗疲劳、增强免疫力、抗氧化、抗肿瘤及促进代谢等多种药理活性，人参皂苷是评价人参质量的重要指标[15-19]。本实验通过研究林型、产地、参龄及坡向对林下参皂苷含量的影响，确定何种条件更有利于获得优质林下参，进而为林下参的种植和采收及应用提供依据[20-22]。长白山区主要分布的林型包括针叶林、针阔混交林、樟子松林与落叶松林等，因此本实验选择了几种有代表性的林型下种植的林下参为研究对象，本研究发现林型对林下参皂苷含量有显著影响，樟子松林型下林下参皂苷含量较高，质量最好，这一结果不但打破了参农们长期形成的樟子松下不能栽培人参的固有观念，相反樟子松较椴树等阔叶林更适宜于林下参的种植，在应用林下参时应作为首选。6 个产地均为林下参道地产区，多数单体皂苷含量差异不显著，但人参单体皂苷Rg1、Rf含量抚松县露水河镇林下参最高，可能是因为海拔、积温、降水量以及光照等因素不同所致，在本实验范围内抚松县露水河镇更适合林下参的种植[23-28]。虽然5～15 a生林下参均达到文献[29]要求，但不同年生林下参单体皂苷含量不同，随参龄的增加Rg1、Rf、Rb1单体皂苷含量提高，而单体皂苷Compound K、原人参二醇含量下降，其次生代谢累计机理有待于进一步研究[30-31]。坡向不同林下参单体皂苷不同，阳坡林下参单体皂苷Rb2、Rb3含量最高，阴坡林下参单体皂苷Rh2含量最高，可能与温度、光照、通风等环境条件有关。通过主成分分析可确定，Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd、Rh4、Rg5、原人参二醇以及总皂苷加和值等皂苷可作为林下参的特征皂苷，在评价林下参质量时，可以此为据。不同林型、产地、参龄及坡向对林下参人参皂苷单体种类没有显著影响，均含有14 种人参皂苷单体Rg1、Re、Rf、Rb1、Rg2、Rc、Rb2、Rb3、Rd、Rh4、Compound K、Rg5、Rh2及原人参二醇，可能是因为林下参中人参皂苷的种类是由林下参基因所决定的，而不受环境条件影响，有待于进一步验证。可见，在林下参的种植、采收、利用等环节中应综合考虑林型、产地、参龄及坡向的选择。