TP-M13-SSR技术在麦芽品种鉴定中的应用

张志军，黄克兴，岳 杰，刘明丽，祁明霞，董建军*

（啤酒生物发酵工程国家重点实验室，青岛啤酒股份有限公司，山东 青岛 266100）

啤酒是以麦芽、酒花、水为主要原料，经酵母发酵作用酿制而成的饱含二氧化碳且乙醇体积分数较低的酒。麦芽作为啤酒的主要原料，是大麦经浸麦、发芽、干燥和焙焦等工艺制得的，不同品种麦芽的酿造特性和啤酒风味存在一定差异，酿造工艺需要根据麦芽品种的特点进行相应调整。现有的麦芽质量参数如浸出率、糖化力、库尔巴哈值等均是反映麦芽混合状态下的平均值，非单粒麦芽质量参数，通过常规质量指标无法对现有麦芽品种进行区分。因此麦芽品种鉴定是评价麦芽质量的重要指标，也是多年来啤酒企业一直迫切希望解决的难题。

目前，大麦品种鉴定技术包括形态鉴别法、蛋白质电泳鉴别法和DNA分子标记法等。Draper[1]利用醇溶蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳进行大麦品种真实性和品种纯度的鉴定。林艳等[2]利用Gel-Pro软件对大麦蛋白电泳图谱进行条带分析和比较，建立了每个品种的蛋白质“指纹”，组成加拿大啤酒大麦品种标准图谱库，但该法存在分辨率低、鉴定结果不够准确的问题[3]。游丽华等[4]利用蛋白质组学技术建立澳大利亚啤酒大麦醇溶蛋白标准图谱。Scobie等[5]利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析西澳种植大麦蛋白质图谱进行品种的快速鉴定。然而大麦经发芽、干燥等制麦工艺后外观特征已发生变化，且醇溶蛋白在蛋白酶的作用下分解，因此大麦蛋白电泳法已不适用于麦芽品种的鉴定。与从大麦叶片中提取DNA相比，麦芽中富含多糖、多酚、氨基酸等物质，DNA分离纯化难度更大。更为关键的是麦芽经84～86 ℃高温焙焦2～3 h后DNA链容易断裂和降解[6]，影响聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）的扩增效果。

随着DNA分子标记技术的开发和利用，DNA指纹图谱逐渐成为鉴定种子真实性的重要方法。简单序列重复（simple sequence repeat，SSR），又称微卫星，是一类由1～5 个核苷酸为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列[7]。作为第2代分子标记技术，SSR标记具有高多态性、重复性、稳定性等优点，广泛应用于植物种质资源鉴定及亲缘关系等方面的研究，包括大麦[8-13]、小麦[14-17]等。谷方红等[6]从46 对SSR引物中筛选到5 个多态性较丰富的引物，可区分实验的8 个大麦及麦芽品种。Lin Yan等[18]利用SSR分子标记进行大麦品种鉴定，基于4 对SSR引物建立17 种大麦品种的等位基因检索系统。Amani等[19]利用11 个SSR标记对31 个北非六棱大麦品种的遗传多样性进行分析。常规的SSR操作是利用聚丙烯酰胺凝胶电泳配合硝酸银染色进行基因多态性分析，该技术存在难以准确读取扩增片段大小、分辨率低等缺点[20]。与常规的凝胶电泳检测法相比，基于DNA测序仪的SSR荧光标记毛细管电泳可以得到目标DNA片段的准确大小，检测结果更为精确，适用于大批量样品的检测分析，具有高灵敏度、高分辨率、快速、自动化、应用范围广等优点。毛细管电泳是以弹性石英毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，依据样品中各组分之间的淌度和分配行为上的差异而实现分离的电泳分离分析方法。毛细管电泳在检测时要求引物必须携带荧光检测器能识别的荧光染料，荧光检测器对标记有荧光染料的扩增产物进行信号采集，通过与各泳道的分子质量内标进行比对，可自动读取产物片段大小。在进行SSR引物初筛时需要检测的引物数量较多，由于每对引物都需要进行荧光标记，因此这种方法的引物合成成本较高。

TP-M13-SSR（simple sequence repeat with tailed primer M13）是基于荧光测序技术的SSR扩增产物检测体系，该法将M13序列作为通用接头引入SSR荧光测序鉴定中，在不同SSR标记进行检测时均可使用，荧光引物成本大幅降低，因此是一种高通量低成本的分析技术。实验中需要增加新的引物进行分析时，合成常规引物即可，不用再合成荧光引物，因此实验成本大幅降低。此技术广泛应用于植物种质资源鉴定及亲缘关系等方面的研究，已在高粱、玉米、苹果等植物的品种鉴定上得到应用[21-25]。

本研究采用TP-M13-SSR分子标记技术，对国内主要使用麦芽品种的等位基因差异性进行研究，筛选多态性引物，构建23 种麦芽品种DNA指纹数据库，为啤酒企业采购商业麦芽提供可靠的品种鉴定手段。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

选择23 个国内常用的啤酒大麦品种进行研究，包括5 个加拿大大麦、11 个澳大利亚大麦、3 个法国大麦和4 个国产大麦，品种名称及来源见表1，其中加麦Copeland和Metcalfe，澳麦Scope、Bass和Commander，法麦Sebastian是国内最常用的进口大麦品种。对上述大麦品种进行微型制麦，得到相应的麦芽样品。制麦条件参考青岛啤酒微麦工艺，14 ℃浸麦44 h，15 ℃发芽4 d，45～70 ℃干燥5 h，84 ℃焙焦3 h，冷却后去根处理，4 ℃保存备用。

植物DNA试剂盒（DNeasy plant mini kit 69104） 德国Qiagen公司；Taq DNA聚合酶、dNTPs 美国Thermo Fisher公司；GeXP试剂 美国Beckman Coulter公司；引物由上海英骏生物技术有限公司合成。

表1 大麦品种及产地Table 1 List of barley cultivars used in this study

1.2 仪器与设备

C1000 Touch™ PCR仪、PAC3000型电泳仪 美国Bio-Rad公司；1-15离心机 德国Sigma公司；CK1000D高通量组织研磨仪 北京托摩根公司；GenomeLab™GeXP遗传分析系统 美国Beckman Coulter公司；Ultrospec2100紫外分光光度计 美国GE公司。

1.3 方法

1.3.1 样品DNA的提取

取单粒麦芽样品于2.0 mL离心管中，加入8 mm钢珠一颗，高通量组织研磨仪1200 r/min粉碎1 min，利用Qiagen植物DNA试剂盒进行提取。提取的DNA用100 μL超纯水或TE溶解，并用2%琼脂糖电泳和紫外分光光度计测定所提DNA的纯度与质量浓度。将所提DNA质量浓度稀释到20 ng/µL，置于－20 ℃保存备用。

1.3.2 SSR引物合成

第1条引物是SSR正向引物的5’端和M13引物相连合成带有M13尾巴的引物，即TP-M13引物；第2条引物为正常的SSR反向引物；第3条引物是5’端标记有Alexa Fluor 750荧光的M13通用引物。所述M13通用引物的引物序列为TGTAAAACGACGGCCAGT。

1.3.3 反应条件

PCR体系反应体积为20 μL，含MgCl22.5 mmol/L，dNTP 0.20 mmol/L，带有M13尾巴序列的特异正向引物0.04 μmol/L、反向引物0.16 μmol/L，M13荧光引物0.12 μmol/L，Taq DNA聚合酶0.5 U，2×PCR缓冲液（不含Mg2+），样品DNA 10～50 ng。反应程序为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30 个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.3.4 产物分离

制备甲酰胺上样缓冲液（sample loading solution，SLS）-DNA分子质量内标（DNA size standard kit，DSS）混合液：取0.5 µL的DSS-400，加入39.5 µL的SLS，涡旋振荡器上混合均匀，加入样品板中。PCR产物稀释处理，样品孔中加入稀释后的PCR产物1 µL，加1 滴石蜡油覆盖样品；在缓冲液板内加入3/4体积的分离缓冲液。将上样板和缓冲板放入GenomeLab™ GeXP遗传分析系统仪中，进样电压2.0 kV，时间30 s；90 ℃变性120 s；分离电压6.0 kV，时间35 min。在毛细管凝胶电泳过程中，PCR产物与DSS-400分子质量内标的荧光信号均由基因分析仪自动保存。

1.3.5 数据分析和指纹图谱构建

用GeneMapper-V3.0软件对GeXP遗传分析系统仪收集到的数据进行分析，通过人工分析与软件统计得出不同麦芽的SSR标记片段。利用软件将SSR标记片段与DSS-400分子质量内标比较，得到SSR标记片段长度大小。

1.4 数据处理

根据麦芽样品扩增片段的毛细管电泳图谱，将检测峰判读为对应的等位基因，纯合位点的等位基因记录为X，杂合位点的等位基因记录为X/Y，其中X、Y为该位点上2 个不同的等位基因片段大小，小片段在前，大片段在后。采用1～9的个位数字和26 个英文字母的组合对检测峰进行编码，数字代表引物顺序，字母代表等位基因编码，每对引物都有对应的数字和字母组合便于快速识别。对一个给定的SSR引物，不同的品种会同时存在几个等位基因，根据等位基因的大小进行排序，最小的定为a，然后根据分子质量的大小依次定位为b、c、d等[26]，从而构建麦芽品种的标准指纹图谱。

2 结果与分析

2.1 多态性引物筛选

根据相关报道[27-29]，从大麦7 条染色体中选择163 对SSR引物，以8 个麦芽品种的DNA为模板，每对引物至少重复实验3 次，选择多态性好的引物作为初筛引物。利用23 个麦芽品种对初筛引物进行二次筛选，最终得到4 对稳定性好、重复性好、PCR稳定的SSR引物，见表2。

表2 引物序列信息及染色体位置Table 2 Primer sequences and their chromosome locations

2.2 SSR引物多态性分析

利用筛选出的4 对SSR引物对23 个麦芽品种进行PCR扩增，获得不同品种在各等位基因上的片段，从毛细管凝胶电泳图谱中选择扩增产物清晰、重复性好的检测峰作为等位基因位点用于品种多样性分析。结果表明，4 对引物共检测出27 个等位基因，每对引物的等位基因为3～10 个不等，平均每个引物产生6.75 个等位基因，多态性良好。其中位点HVM68多态性最丰富，在183～313 bp之间包括10 个等位基因；位点HVWAXYG多态性其次，在185～222 bp之间含有9 个等位基因；位点EBmac755在144～159 bp之间含有5 个等位基因；位点Scssr10148多态性最低，在199～241 bp仅含有3 个等位基因。扩增产物片段大小的差异可以用于麦芽品种的区分，引物扩增片段的等位基因数越多，越能反映不同品种的差异。

2.3 麦芽品种SSR指纹图谱的建立

图1 Copeland（A）和Baudin（B）在4 个SSR位点的TP-M13-SSR指纹图谱Fig. 1 TP-M13-SSR fingerprinting of Copeland (A) and Baudin (B) at 4 SSR loci

利用4 对引物的组合构建全部23 个麦芽品种的TPM13-SSR指纹图谱。每个品种在不同引物下的扩增产物在毛细管电泳上进行分离后，根据电泳图谱上的峰值变化将主要检测峰判读为对应的等位基因，综合扩增产物的电泳图谱和等位基因大小，就构成了每个麦芽品种的SSR指纹图谱，作为麦芽品种间区分的判定依据。如图1所示，对全部麦芽品种的电泳图谱进行比较，发现每一个麦芽品种在4 对引物下都有自己独特的指纹图谱组合，因此通过指纹图谱可实现不同麦芽品种的有效区分。

表3 23 种麦芽在4 个SSR位点的标准指纹数据Table 3 Standard fingerprint data of 23 varieties of malt at 4 SSR loci

根据每个麦芽品种在4 个位点上等位基因差异的变化，按照引物顺序建立23 个麦芽品种的指纹数据，如表3所示。不同麦芽品种间等位基因之间差异大小不等，加麦Copeland和澳麦Baudin在4 对引物中等位基因大小均不相同，二者差异明显，易于区分；而同为加麦的Copeland和Metcalfe二者在引物Scssr10148、HVWAXYG和EBmac755上等位基因大小完全一致，只在引物HVM68才有差异，说明2 个品种比较接近区分难度较大。

2.4 麦芽品种的区分

表4 23 种麦芽在4 个SSR位点的的SSR标准指纹编码Table 4 SSR standard fingerprint coding of 23 varieties of malt at 4 SSR loci

根据SSR指纹图谱，将每对引物扩增的条带按照从小到大的顺序排列，依次编码[30]。本研究利用4 对多态性丰富的SSR引物可准确鉴别的23 个麦芽品种，各麦芽品种的特征指纹代码见表4。按照固定引物顺序将每个品种指纹图谱所对应的编码按特定的引物顺序排列起来，就构成了代表各品种身份的特征指纹代码，4 对引物下加麦Copeland指纹代码为1h2g3d4c，澳麦Gairdner的指纹代码为1a2e3e4c。如检测某未知麦芽样品，可先用4 对特定引物对待测麦芽样品进行PCR扩增和毛细管电泳检测，将等位基因型所对应的代码按引物顺序排列起来，与标准麦芽的指纹代码进行比对，即可直观地判定出待测样品是否是目标品种，从而实现麦芽品种真实性的判断。采用1～9的个位数字和26 个英文字母的组合对检测峰进行编码，每对引物都有对应的数字和字母组合便于快速识别，避免了仅使用数字编码时因等位基因过多需要两位数字进行编码的情况。

表5 23 种麦芽品种区分的等位基因组合Table 5 Allele combinations for identification of 23 malt varieties

如表5所示，23 个麦芽品种中4 对引物可单独区分的品种为0～5 个不等，HVM68可直接区分5 个品种，HVWAXYG可区分3 个品种，Scssr10148和EBmac755可区分0 个品种。引物间相互组合提高可区分品种数量，进而确定引物的最佳组合。两引物组合中HVM68和HVWAXYG组合可实现17 个品种的区分，区分率最高，为73.9%；引物Scssr10148和EBmac755组合可实现6 个品种的区分，区分率最低，为26.1%。可根据两引物组合的结果继续增加引物数量，提高品种的区分能力。在HVM68和HVWAXYG组合基础上，增加EBmac755可实现23 个麦芽品种的全部区分，区分率为100%，该组合为最佳引物组合。因此仅需要3 对核心引物（HVM68、HVWAXYG和EBmac755）的组合即可实现全部23 个麦芽品种的区分。未来随着麦芽品种数量的增加，某些品种间的指纹图谱可能完全相同，4 对引物组合的鉴定能力可能会逐渐降低，可通过增加新的多态性引物提高引物组合的区分能力。

3 结 论

常用的SSR分析是利用聚丙烯酰胺凝胶电泳结合银染进行片段多态性分析，该法灵敏度和分辨率较低，不能准确量化扩增片段的大小，无法在不同凝胶图谱之间进行横向比较。基于DNA测序仪的SSR荧光标记毛细管电泳可以得到目标DNA片段的准确大小，具有高灵敏度、高分辨率、快速、自动化、应用范围广等优点。TPM13-SSR技术是SSR技术与荧光自动测序技术的完美整合，在大批量引物筛选的情况下，M13通用引物可大大降低SSR引物荧光标记的成本，方法简便可靠，适用于麦芽品种指纹图谱的构建。本研究从163 对SSR引物中筛选到4 对多态性丰富的SSR引物，每对引物的等位基因为3～10 个不等，平均每个引物产生6.75 个等位基因。利用4 对SSR引物构建23 个麦芽品种的指纹图谱及对应的数据库，仅需3 对核心引物即可实现全部麦芽品种的区分，该法检测成本低，方法准确可靠，可实现国内啤酒行业常用麦芽品种的真实性鉴定，从源头上保障啤酒原料的品质，为啤酒企业在麦芽采购环节提供技术支持。