脂肪干细胞通过旁分泌作用改善异种脱细胞真皮基质体内植入效果的机制研究
2019-01-07朱朱袁兆琪黄成杨军罗旭松
朱朱 袁兆琪 黄成 杨军 罗旭松
脱细胞真皮基质(ADM)是一种具有良好生物相容性及生物力学性能的天然来源材料,临床上常用于乳房重建或与自体皮片联合使用以修复深度创面[1-3]。由于异体脱细胞真皮基质来源短缺且价格昂贵,而异种(猪)脱细胞真皮基质(HPADM)与人来源ADM(hADM)在组织学上具有高度相似性,是代替hADM的合适材料[4]。但是,ADM类材料结构过于致密,植入人体后难以快速、充分地细胞化及血管化,导致其临床应用受到一定限制[5]。此外,尽管去除了免疫原性的细胞成分,异种ADM植入人体后仍表现出一定的慢性炎症反应[6],这是HADM临床应用的两大限制因素。
脂肪干细胞(ADSCs)是组织工程研究中广泛应用的种子细胞[7],其旁分泌作用能产生一系列的促血管形成及炎症调节因子[8-9]。由于不同的支架材料能形成各自独特的生物微环境,并能通过细胞-材料间的相互作用而改变在其中生长的种子细胞的生物学行为[10-11]。因此,我们尝试探索HADM能否为ADSCs发挥其旁分泌功能提供合适的、有益的微环境,并探讨ADSCs体外预培养对HADM植入人体后的血管化及炎症反应的影响。
1 材料与方法
1.1 实验材料
Fisher 344雄性大鼠 (本院动物实验中心);HADM(江苏优创生物医学科技有限公司);引物(上海生物工程股份有限公司);CCK-8试剂盒 (Dojindo,日本);qRT-PCR 试剂盒(Applied Biosystems,美国);ADSCs诱导分化试剂盒(Cyagen,美国)。
动物实验经过本院伦理委员会批准,审批号:HKDL[2018]214。
1.2 实验方法
1.2.1 HADM性质检测
大体观察:用数码相机在同一高度、相同比例尺下对HADM进行拍摄,显示其大体形态。
电镜检测:将HADM放置于2.5%戊二醛中固定,后转至1%的锇酸中固定;固定后的材料置于梯度乙醇脱水,临界点干燥,扫描电镜观察并拍摄。
组织学染色:HADM多聚甲醛固定,乙醇干燥脱水,包埋,5 μm厚度切片,HE染色。
1.2.2 ADSCs获取、培养及鉴定
从大鼠两侧腹股沟获取脂肪组织,酶消化法获取原代ADSCs,以含10%胎牛血清的低糖DMEM在37℃、5%CO2下培养,0.05%胰酶消化换代。
取第2代 ADSCs,以2×105个/孔的密度接种于6孔板中,按照ADSCs诱导分化试剂盒说明书进行诱导分化,茜素红染色检测成骨分化能力、油红O染色检测成脂分化能力。
1.2.3 细胞材料相容性检测
电镜观察:将材料裁成24孔板大小(约1.9 cm2),消毒后置于24孔板内,按1×105个/孔的密度接种ADSCs,48 h后进行电镜观察。
浸提液检测材料毒性:材料置于24孔板中,1 mL DMEM(含10%胎牛血清)浸没72 h,收集上清液并过滤。将ADSCs以2×104个/孔的密度接种于96孔板中,分别用浸提液及普通完全培养基 (低糖DMEM+10%胎牛血清)培养 7 d,于第 1、3、5、7 天加入CCK-8试剂,培养箱孵育2.5 h后于450 nm处行吸光度检测。
1.2.4 ADSCs在不同培养条件下的旁分泌因子表达情况
将ADSCs以1×105个/孔的密度接种于24孔板或相应大小的HADM上培养48 h,用Trizol提取全部细胞中的RNA,并用qRT-PCR法检测ADSCs在不同培养条件下的促血管形成因子(VEGF、HGF、bFGF)、炎症调节因子(TGF-β、iNOS、TSG-6、COX-2)及干性基因(SOX-2)的表达情况(表 1)。
1.2.5 ADSCs体外预培养对HADM植入后的血管化及炎症反应的影响
将 ADSCs以 5×104cells/cm2的密度接种于HADM 上(2 cm×2 cm 大小),DMEM+10%胎牛血清培养1周后备用。
在大鼠背部形成一2 cm×2 cm大小的U型皮瓣,掀开皮瓣,将HADM缝合到底部筋膜上并关闭切口。实验组移植经ADSCs体外预处理的HADM,对照组则移植未经处理的HADM。术后4周取材,将样本与周围组织一同取出,固定后行组织学检测。1.2.6 统计学分析
以GraphPad7软件分析数据,计量资料以(x±s)表示,组间比较采用t检验,P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 HADM大体形态、电镜及组织学形态
HADM呈瓷白色,柔软且有一定弹性,厚度大约0.15 mm。电镜显示其粗糙面有绒毛样外观而光滑面则有沟壑。HE染色显示HADM中无细胞、皮肤附属器等成分,真皮基质大部分由胶原组成(图1)。
2.2 ADSCs的培养鉴定及HADM的毒性检测
ADSCs呈长梭形,原代细胞培养3~4 d可形成集落,约1周后可传代。成骨诱导28 d后,茜素红染色可见散在的红色结节;而成脂诱导21 d后油红O染色可见红染的脂滴(图2a-c)。
电镜观察显示,ADSCs在HADM上培养48 h后细胞黏附良好,细胞可从材料上伸出类似伪足的结构,证明细胞能够完全铺展。CCK-8结果显示,HADM浸提液培养的ADSCs在第1和第7天时的细胞增殖情况,与完全培养基培养的ADSCs没有统计学差异,说明HADM无明显细胞毒性;而第 3和第5天时的增殖速度略慢于完全培养基 (P<0.05),这可能是由于HADM的浸提液中含有能够维持ADSCs干性的成分,使得其增殖略慢(图2d-f)。
2.3 ADSCs在不同培养条件下的旁分泌因子表达
qRT-PCR检测结果表明,在HADM微环境下培养的ADSCs与在普通培养皿上培养的ADSCs相比,其促血管生成因子、炎症调节因子以及干性因子等均有所上调,且结果有统计学差异(P<0.05)。
其中,参与多条炎症通路调节的TGF-β上调了2.26倍;编码PGE2蛋白这一重要巨噬细胞炎症反应的因子COX-2上调了3.6倍;抗炎因子TSG-6则上调了4倍;与ADSCs活化相关的炎症因子iNOS上调了2.14倍,而干性因子SOX-2则提高了6.7倍。VEGF、HGF和bFGF是三个重要的促血管形成因子,在血管形成的3种方式,即血管发生(Vasculogenesis)、血管新生(Angiogenesis)及动脉形成(Arteriogenesis)中均有重要作用,而ADSCs这三种因子表达在HADM上培养时比在普通培养皿上培养时分别升高了2.7倍、1.9倍和8倍(图3)。
图1HADM性质Fig.1 Characterization of HADM
2.4 ADSCs体外预培养对HADM植入体内后的血管化及炎症反应的影响
组织学显示,经预培养的HADM在体内4周后可见大量新生血管形成,且宿主细胞能够均匀渗透到材料内部;而未经处理的HADM中新生血管明显较少,且主要分布在材料周边。宿主炎症反应方面,经过预处理的HADM炎症反应较轻微,且主要集中于材料外周;而未经处理的HADM炎症反应明显更强,炎症细胞在材料的中间及周围广泛分布。上述结果提示,ADSCs体外预培养能够促进移植物植入体内后的新生血管形成,并缓解其炎症反应(图4)。
图2 ADSCs形态、多向分化潜能及HADM细胞毒性Fig.2 Morphology and multilineage differentiation potential of ADSCs and cytocompatibility of HADM
图3 HADM微环境对rADSC旁分泌功能相关基因的影响(*:P<0.05)Fig.3 Effect of HADM microenvironmenton on the rADSC paracrine related gene expression(*:P<0.05)
图4 体内培养4周后各组HADM组织学观察Fig.4 Histological analysis of HADM in each group after cultured for 4 weeks in vivo
3 讨论
在前期的软骨构建研究中我们发现,移植物的炎症反应可能是影响组织工程构建结果的重要因素。将软骨细胞与支架材料体外预培养后,软骨细胞能够分泌细胞外基质,包裹支架材料以隔绝材料与宿主组织的直接接触,从而能够显著提升构建软骨的质量[12]。虽然HADM去除了免疫原性的细胞成分,大大降低了其植入体内后的宿主免疫反应,但仍有不少报道称HADM仍能引起慢性炎症反应,从而影响HADM植入体内后的效果[13-14]。因此,我们设想能否通过将ADSCs与HADM体外预培养来解决以上问题。本研究结果显示,经ADSCs预培养的HADM植入体内后,其炎症反应较对照组明显降低。其机制不同于软骨细胞这类成体细胞,ADSCs并不能分泌可观的细胞外基质,并且大量研究认为,由于移植后复杂的宿主反应,ADSCs的多向分化能力与其治疗性作用的关系也不大,而ADSCs的旁分泌产物则有可能在此过程中起到关键作用[15]。ADSCs能够分泌包括促血管形成的VEGF、HGF[16],调节炎症反应的TGF-β、TSG-6等众多营养因子[17],在促进血管形成、炎症调节、抗凋亡、抗瘢痕形成以及调节宿主自身的祖细胞、干细胞方面有重要作用。有研究报道,ADSCs能够改善支架材料植入体内后的生物相容性及血管形成[18],亦与本研究结果一致。
近期的研究显示,支架材料由于其拓扑结构、力学性能、化学性质等的差异,能够形成特殊的微环境,通过细胞-材料的相互作用对细胞行为产生影响[19-20]。然而,HADM能否为ADSCs旁分泌功能提供合适的微环境,目前尚未有文献报道。本研究首次证明,HADM所产生的微环境能够提高炎症调节因子(TGF-β、iNOS、TSG-6、COX-2)、 促血管形成因子(VEGF、HGF、bFGF)表达上调。 有研究提出,使用聚已酸内酯(PCL)材料证明,PCL来源的电纺丝材料能够对ADSCs的旁分泌功能产生促进作用,亦与本研究结果一致[21]。但不同的是,本研究中,ADSCs在HADM环境中培养时,iNOS这一促炎因子的水平亦明显降低。这可能是由于电纺丝材料制备过程当中的毒性物质残留,或者PCL材料降解时产生酸性物质。作为一种天然来源的材料,HADM在这一方面有明显的优势。
本研究证实,将ADSCs与HADM体外预培养能够促进HADM植入体内后的血管形成,并缓解其炎症反应。其可能的机制在于ADSCs旁分泌所产生的营养因子,可促进了新生血管的形成,并调节炎症反应的强度。此外,我们还证明了HADM所产生的微环境能够强化ADSCs的旁分泌作用。今后,我们将进一步优化HADM,从而为其更广泛的应用于临床奠定基础。