肿瘤大基因包高通量测序在临床中的应用进展

2019-01-06

中国肿瘤临床 2019年2期

近年来，随着基因组学和转化医学的快速发展，人们对肿瘤的认识已从组织水平深入到分子水平，越来越多的肿瘤分子标记物被发现，在临床上基于各种分子标记物的靶向治疗和免疫治疗表现出极大的抗肿瘤活性，引领了肿瘤治疗领域的重大突破。以高通量测序为基础的分子诊断愈发重要，因此本文就大基因包（panel）高通量测序在肿瘤诊断和治疗中的应用进行分析，探讨其如何应用于临床并指导临床诊疗。

1 高通量测序panel的分类

高通量测序的panel多种多样，从panel所涵盖的基因数目来看，大致可以分为小panel、中panel和大panel。小panel常涵盖几个至几十个基因，主要根据相应治疗指南中药物的推荐，针对某一癌种的检测，检测与实际靶向用药直接相关，以指导患者的治疗。中panel常针对与肿瘤相关的几十个基因进行检测，其涵盖美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）/中国国家药品监督管理局（Na⁃tional Medical Products Administration，NMPA）等批准的多癌种靶向药物的靶点，甚至包含临床试验相关靶向药物的靶点等，为多癌种的靶向治疗提供参考。大panel常涵盖几百个基因，涉及已批准靶向药物的基因位点，临床实验药物相关的基因位点，肿瘤信号通路相关基因位点、耐药基因位点、罕见基因等，此外大panel可评估患者肿瘤突变负荷（tumor mutation burden，TMB）的水平进而预测免疫治疗的疗效。2018年7月至11月，中国NMPA批准4款高通量检测的三类医疗器械产品上市，均为小panel试剂盒，针对性和实用性皆强。2017年年底，FDA审批通过2个基于大panel的基因检测分析平台，对整个精准医疗产生巨大影响。2017年11月15日，美国FDA正式批准纪念斯隆凯特琳癌症研究中心的癌症基因检测分析平台MSK-IMPACTTM用于癌症患者468个基因检测，主要用于检测点突变（single-nucleotide variant，SNV）、插入缺失（insertion/deletion，InDel）和微卫星不稳定性（microsatellite instability，MSI），但不用于伴随诊断，亦未注明检测TMB。2017年11月30日，美国FDA跟医疗保险和医疗补助服务中心（CMS）同时批准Foundation Medicine公司旗下产品FoundationOne CDx（F1CDx）用于泛癌种临床伴随诊断，这是首款突破性的基于高通量测序技术（next-generation se⁃quencing，NGS）的体外伴随诊断产品，针对324个基因进行检测，包括SNV、InDel、拷贝数变异（copy num⁃ber variation、CNV）、结构变异（structure variation，SV）、MSI、TMB，MSI和 TMB作为分子标志物进行检测。提示基于NGS方法检测肿瘤组织TMB正式被认可。

2 大panel在肿瘤临床中的应用

2.1 大panel在肿瘤诊断中的应用

在分子分型上，大panel可以对原发灶不明（can⁃cer of unknown primary，CUP）肿瘤的分析提供依据。Rekhtman等［1］使用MSK-IMPACT对肺大细胞神经内分泌癌进行分析发现，根据不同的基因突变特征可以将其细分为2种大亚型和1种小亚型：小细胞样，携带TP53+RB1共突变/缺失和其他小细胞型的基因改变，如MYCL基因扩增；非小细胞样，缺少TP53+RB1共同改变以及常在非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）中发生的基因突变（STK11，KRAS，KEAP1）；肉瘤样，携带MEN1突变和低的突变负荷。3种亚型具有明显不同的基因特征，而且小细胞样和非小细胞样患者具有不同的临床病理特征。

此外，对于CUP肿瘤临床医生往往很难进行治疗决策，Ross等［2］使用 FoundationOne的研究发现，96%患者至少检测到1个基因变异，平均每位患者检测到4个基因变异，许多基因变异均有对应的抗肿瘤药物，如厄洛替尼、克唑替尼和维莫菲尼，或在进行临床研究的药物，多达85%患者可获得临床干预的机会，大大提高了CUP患者的治疗可能性。

最后，大panel可以提供预后相关信息，Bielski等［3］使用MSK-IMPACT测序平台对9 692例晚期癌症患者（含55种肿瘤类型）的肿瘤样本和血液配对样本进行靶向测序，结果发现近30%肿瘤患者中存在全基因组倍增（whole-genome doubling，WGD），是与癌症类型预后不良相关的宏观进化事件相关，是患者预后有效的提示。

2.2 大panel在肿瘤治疗中的应用

2.2.1 大panel在肿瘤靶向治疗中的应用在靶向治疗方面，大panel涵盖的肿瘤相关基因越多，患者有可能接受靶点干预的可能性越高，特别是对于携带罕见基因突变以及耐药基因突变的患者，由于受中小panel NGS或其他基因检测方法涵盖的基因位点数量限制，部分患者可能会漏检。在Rozenblum等［4］使用FoundationOne和Guardant360的NGS方法进行回顾性研究发现，42.6%患者的治疗方案发生改变，客观缓解率（objective response rate，ORR）为65%，且在常规EGFR/ALK的分子检测阴性患者中，17.4%（15/86）患者EGFR/ALK检测到存在变异。2018年11月26日，美国FDA加速批准了TRK抑制剂拉罗替尼（larotrectinib，vitrakvi）用于治疗携带NTRK基因融合的晚期或转移性实体瘤的成人和儿童患者，是获批的第一个与肿瘤发生位置无关的广谱抗癌靶向药。在常见肿瘤类型中，携带这一融合基因的患者比例较低，而携带罕见突变的患者将受益于大panel检测，可获得新药治疗的机会。

与外显子组测序（whole-exome sequencing，WES）相比，大panel检测同样展现出优势，可提高突变检出率，Zehir等［5］使用MSK-IMPACT对10 000例患者进行检测发现，至少有9%的癌症相关突变WES未检测到，一些融合基因WES亦未检测到。对于一些重要的非编码区域，如TERT基因的启动子区域WES常常不覆盖，而基于MSK-IMPACT的研究表明在黑色素瘤、尿路上皮癌和甲状腺乳头状癌中，携带TERT基因启动子区域突变患者的生存率明显低于未突变的患者。研究人员发现，在10 000例患者中，36.7%患者携带至少1种可用MSK-IMPACT检测到的突变，提示可入组至相关靶向药物的临床试验。在此研究中，11%的患者均参与了不同靶向药物的临床试验。

大panel在肿瘤靶向治疗中的应用充分体现了伞式研究（umbrella trial，同时完成不同的药物相关靶点的检测，根据不同的靶基因给予不同的精准靶向药物）和篮式研究（basket trial，一种药物应对不同的肿瘤类型）的精髓，加速促进肿瘤精准治疗的发展［6］。

2.2.2 大panel在肿瘤免疫治疗中的应用大panel可以通过评估TMB来预测免疫治疗的疗效。TMB定义为基因组中每1 Mb蛋白编码区（coding sequence，CDS）的平均突变个数［TMB=CDS区域内体细胞突变的数量/CDS区域的长度（MB）］，最好的方案是对肿瘤进行WES以准确计算TMB。但因肿瘤异质性等原因，肿瘤体细胞测序对测序深度要求较高，常常在500×以上，而常规的全外显子测序深度低，高深度的WES成本非常高，具有较多的临床应用限制。研究表明，大panel与WES的检测结果相关性较高，可用来替代全外显子测序来计算TMB［7-10］。Panel所涵盖的基因与肿瘤的关联性，基因数量、检测区域、CDS区域大小均对TMB具有重要影响，一般大panel的基因数量建议在300个以上［10］，CDS区域在1.5～3.0 Mb之间［9］。对于免疫治疗，大panel除了可以用来评估TMB外，通常还涉及MSI和DNA错配修复（mismatch repair，MMR）相关基因的评估，大panel高通量检测逐渐获得临床应用推广。

Yarchoan等［11］曾报道，在27种肿瘤类型/亚型中，TMB和接受程序性细胞死亡蛋白-1（programmed death-1，PD-1）及其配体（PD-L1）抑制剂的免疫治疗后ORR具有明显的线性相关性，TMB越大，PD-1抑制剂有效率越高。不同患者接受PD-1抑制剂治疗有效率差别大，其中55%的差异可以通过TMB高低来解释。TMB越高，癌细胞产生的新抗原越多，肿瘤免疫原性越强，被免疫细胞识别的可能性更高，越适合免疫治疗，患者从免疫治疗中获益越多。Goodman等［12］的研究使用FoundationOne方法对1 638例患者TMB进行评估，其中151例接受过PD-1抑制剂治疗。根据TMB分成高、中、低3组，相比TMB中或低的两组患者，TMB高的患者有效率（response rate，RR）（58%vs.20%）、无进展生存期（progression-free survival，PFS）（12.8个月vs.3.3个月）、总生存期（over⁃all survival，OS）（未达到vs.16.3个月），均明显提高。Carbone等［13］报道Checkmate-026的研究证实高水平TMB免疫治疗有效性增加：高TMB亚组（≥243个突变）纳武单抗的ORR较化疗明显提高（47%vs.28%）且PFS明显延长（9.7个月vs.5.8个月）。此外，Hell⁃mann等［14］报道以TMB作为筛选标准（TMB高于10个突变/Mb）的三期临床试验Checkmate-227（NCT02477826）取得成功。在TMB高于10个突变/Mb的晚期NSCLC中，PD-1抗体纳武单抗（nivolum⁃ab，opdivo）联合伊匹单抗（ipilimumab，yervoy），一线治疗战胜了铂类双联标准方案化疗，纳武单抗加低剂量伊匹单抗治疗明显延长了1年的PFS率（42.6%vs.13.2%），PFS也显著延长（7.2个月vs.5.4个月）。该研究结果是在全球范围内首次在Ⅲ期临床试验中证实：无论PD-L1表达水平如何，NSCLC患者通过FoundationOne CDx（F1CDX）大panel的检测评估为高TMB，联合免疫治疗能够使这部分患者PFS显著获益。同时，临床试验CheckMate-568（NCT02659059）结果也表明，在接受纳武单抗联合伊匹单抗治疗的NSCLC患者，无论PD-L1表达水平如何，TMB≥10个突变/Mb患者中位PFS几乎为TMB＜10个突变/Mb患者的3倍（7.1个月vs.2.6个月）。CheckMate-227和CheckMate-568奠定了基于大panel评估TMB的临床应用价值。TMB的应用可以有效鉴别真正能够得到免疫治疗临床获益的患者，可以作为独立可靠的免疫治疗预测标志物。2018年10月，美国国家综合癌症网络（NCCN）发布了NSCLC指南2019年（第1版），该版本首次将TMB纳入其中，用于识别适合接受“纳武单抗+伊匹单抗”双药联合免疫治疗和“纳武单抗”单药免疫治疗的肺癌患者。

免疫治疗在实体瘤的临床治疗中取得重大突破，已成为肿瘤患者最有效的治疗方法之一。但在未经筛选的患者中，免疫治疗单药有效率偏低约为20%。基于大panel的TMB、MSI等分子标志物可筛选出免疫治疗获益人群，而Gainor等［15］研究发现，携带EGFR或ALK明确基因突变的患者免疫治疗ORR显著较低。Rizvi等［7］使用MSK-IMPACT也观察到在接受PD-1/PD-L1抑制剂治疗的NSCLC中，和无持久获益（no durable benefit，NDB）的患者相比，6个月以上临床获益（部分缓解/稳定）（durable clinical benefit，DCB）的患者中TMB高，且PFS更长；而在EGFR和STK11突变的患者中免疫治疗疗效欠佳。Offin等［16］使用MSK-IMPACT对已经服用一、二代酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitor，TKI）药物EGFR突变患者的研究发现，高TMB患者的治疗停止时间（timeto-treatment discontinuation，TTD）和OS明显缩短，随访发现，患者出现TKI耐药时，TMB明显增加。这也就意味着TMB是接受EGFR-TKI治疗的转移性EG⁃FR突变肺癌患者临床预后的负性因子。因此，大panel评估TMB可以同时考量对影响免疫治疗疗效驱动基因的变异状态。

除了MSK-IMPACT和F1CDx两个大panel外，包括Illumina在内的多家平台都开发了肿瘤相关的大panel用于TMB评估［9］，临床应用的意义尚需进一步评估。

TMB评估目前主要是基于肿瘤组织的检测，而部分患者无足够或无法活检到肿瘤组织［17］。而在POPLAR（NCT01903993）和OAK（NCT02008227）两项临床试验中，评估基于大panel的血液肿瘤突变负荷（blood TMB，bTMB）对于免疫治疗药物疗效预测仍具有有效性，对于组织肿瘤突变负荷（tissue TMB，tTMB）高的人群均能够从免疫治疗中获益［18］。该结果提示bTMB能够作为免疫治疗的潜在无创生物标志物。

2.3 大Panel临床应用中遇到的问题

随着肿瘤靶向治疗和免疫治疗的迅速发展，肿瘤分子诊断已成为高通量测序医疗应用领域的爆发性增长点。大panel在临床应用中仍要面对诸多挑战。首先，使用大panel评估TMB是衡量免疫治疗的重要方法之一，但在不同的大panel研究中涉及到基因不同，筛选计算TMB的体细胞突变条件也不相同。在FoundationOne的方法中，筛选出编码区域体细胞SNV/Indel包含同义突变用于计算TMB，但不包含Cosmic数据库中记录的突变也不包含抑癌基因的截断突变［19］。在基于MSK-IMPACT一项结直肠癌相关的研究中，计算TMB的位点为编码区域体细胞SNV/Indel但不包含同义突变［20］。大 panel评估TMB需与WES评估TMB进行一致性比对，以WES为基准，规范大panel评估TMB的评价体系。目前，不同的TMB计算方法孰优孰劣，尚无统一标准。2018年10月，NCCN发布的2019年（第1版）NSCLC指南首次将TMB纳入其中，用于识别适合接受免疫治疗的肺癌患者，但对于如何衡量TMB，目前尚未达成共识，亟需积累更多的数据以促进评估TMB方法的规范化。

其次，在大panel的数据解读中，通过大panel的检测，可以获得更多基因位点信息，同样也会获得大量意义不明的变异（variants of uncertain significance，VUS），其临床意义不明，但也可能在其他癌种中具有潜在治疗价值［21］。实验室和临床之间的连接不易，公共数据库中变异位点的信息，如获得的对蛋白质的功能影响和对治疗反应的信息，有助于变异的解读。越来越多的高通量VUS功能评估出现，对于大量VUS功能的解读会有快速提升［22-23］。在解读中，对于VUS的管理，针对变异位点的综合分析至关重要。对于肿瘤患者进行检测，特别是大panel检测之前，建议患者进行遗传咨询，知情检测结果出现的多种可能性，以及对未来疾病管理的建议和家庭计划生育的选择［24］。

最后，在使用大panel检测的整个过程中，从接收临床样本到出具完整的报告，从湿实验到干实验，质量评估和控制也是重要问题，需要进一步摸索与规范。最后，高通量测序大panel在临床研究中证实了其临床可用性，而在实验性能确认和临床验证中要面对下述多方面的问题；1）大panel中涉及上百个基因的突变位点，如何在性能确认中将panel所覆盖范围内的所有位点进行评估，如果进行选择性基因突变位点的性能评估，如何做到所选择评估的范围和基因可以完整体现整个大panel的实验表现；2）大panel中涉及罕见的基因变异位点，如何在临床验证中对罕见变异进行评估；3）对于无热点突变的基因，如何在实验性能确认和临床验证做到有效评估。在上述方面，明确大panel试剂预期用途的前提下，针对试剂的精密度、准确性、检测下限和分析特异性，对重要常见基因的检测能力进行评估，对不同变异类型的检测能力进行评估，并且对高度重复区域，GC含量高的区域进行评估。和小panel产品相比，大panel产品在性能确认和临床验证方面，更需明确其预期用途，与药物临床试验相结合共同推进为有效规范的途径之一。