提高和牛冷冻精液生产质量关键措施

丁丽艳 韩永胜 李同豹 李平

（黑龙江省畜牧研究所150000）

1 和牛种子公牛的选择

种子公牛的质量是生产高质量精液的前提和保障，对牛群的发展及品种改良起着重要作用。选择依据的标准主要包括系谱、自身、后裔选择。根据系谱选择其父母代繁殖性能、各阶段体重与增重、饲料报酬及与肉用性能有关的外貌表现都良好的后代，并经过后裔测定合格留作种用。

对和牛种公牛自身的选择，包括生长发育、体质外貌、体尺体重、早熟性及精液质量等性状。要求全身结构匀称，健康无疾病，体质强壮，精神状态好，毛皮光滑，体况良好，膘情适宜，雄性特征明显，生殖器官发育良好，睾丸大小正常，有弹性。当小牛长到1岁以上就可以直接测定其某些经济性状，如12月龄以上的活重、育肥期增生效率等。选择适宜于遗传力高的性状。精液质量好，正常情况下鲜精活力不低于0.7，畸形精子不高于20%。

2 种公牛的培育

2.1 饲养

种公牛的繁殖性能、精液质量与饲料有密切相关。种公牛的饲料要求必须营养全价、种类多样、搭配合理、适口性好、易于消化。饲喂种公牛时要多饲喂高蛋白和青干饲料，少喂能量饲料和多汁饲料。饲料中除了一些基础类营养物质外，还要注意其他一些微量营养物质的含量，如VA、VE、锌、铜、铁、硒等的缺乏会导致精子数量减少、活力降低、畸形率增加，受胎率降低。除了饲料营养外，还要保证饲料品质，严禁饲喂发霉变质的饲料。由于青贮饲料饲喂过量会影响种公牛精液的品质，饲喂时要掌握好饲喂量，一般每天保证每天饲喂10kg以下。

非采精期和采精期种公牛的饲养方法和营养需求不同。种公牛在非采精期营养的供给主要为了抓膘复壮，为采精打下良好的身体基础，因此，要给足草料，防止种公牛掉膘，但同时也要注意避免饲喂过肥，否则会影响性欲和精液质量，精料饲喂量为2～3kg/d；采精期需要营养充足，要提高日粮的营养水平，尤其蛋白质水平，避免种公牛在采精期掉膘，并生产出优质的精液，精料的饲喂量为4～5kg/d。

2.2 管理

种公牛要有专人进行饲养管理，不可以随意更换。要求管理人员胆大心细，温柔对待公牛，严禁抽打。定期（3个月左右）对种公牛进行称重，使种公牛保持中等膘情，根据称重结果及时调整饲喂方法或饲料配方，防止牛只过肥。要加强对种公牛外生殖器官的护理，定期按摩。

种公牛要保证有充足的运动量，适当运动可保持种公牛强健的体质，使牛身体健康、行动灵活、易于配种，性情温顺，还可保持较为旺盛的性欲，提高精液质量。舍饲种公牛每天保证有2h的运动量；每天刷拭牛只被毛1～2次，重点刷头部和颈部，这样能保持体表卫生、减少体外寄生虫病、促进血液循环作用。控制好种公牛的采精频率，一般在18月龄时开始采精，刚开始时每隔10～15d采精1次，以后可增加至每隔3～4d采精1次，采精频率还要根据季节的变化合理安排，夏季可每周采精1次，并在早上或者傍晚较为凉爽时进行，冬春季节可每周2次。种公牛在3～4岁时精液质量最佳，要把握好这个时机，5岁以后繁殖机能开始下降。

温度对精液的品质影响较大，尤其是高温，如果温度超过31℃会使种公牛产生热应激，导致种公牛的食欲减退，采食量下降，体况不佳。牛体温度升高后会引起阴囊和睾丸的温度升高，影响精子生成，还会导致精子的各项指标不达标，因此，要加强种公牛夏季的防暑降温工作，可以在牛舍和运动场周围搭设凉棚或种植树木。注意牛舍的通风，给牛饮用清凉的井水，并适当喂盐水。采精时要尽量避开高温时段，并减少采精次数。

⑤手术目标：为了降低术后并发症发生率，在手术治疗过程中，应严格遵守无菌操作原则。术后应加强呼吸护理、胸管护理[2]。由于肺部手术患者创伤性较大，术后保持呼吸通畅较为困难，因此患者术后需持续吸氧，并定时对患者进行拍背咳痰，在拍背时需注意控制力度，当痰液过于粘稠时，需进行雾化吸入，口服化痰药物。保证患者有效排痰、呼吸通畅，预防呼吸衰竭或肺部感染。

合理防疫，做好疫苗接种工作，减少免疫使种公牛产生应激反应，否则会导致精液品质下降。在注射疫苗期间要加强日粮中营养物质的浓度，以减少应激，在生产中应合理安排疫苗注射时间，并尽量减少免疫次数，避开精液生产的高峰期，以减少接种疫苗对精液的毒性作用。

2.3 采精训练

种公牛的采精训练对生产高质量的精液及种公牛的使用年限非常关键。

对种公牛训练过早、过晚都不利于优质种公牛繁殖性能的发挥。训练过早，种公牛未达体成熟，不仅会抑制公牛正常发育及健康水平，生产的精液品质也较差。训练过晚，不但训练困难，而且优质种公牛利用年限缩短，效益降低，因此，为了充分发挥和牛公牛的种用价值，对其训练的最佳时期是18月龄以前。

训练时间最好选择清晨，训练之初，采用观摩其他公牛采精的方式来训练，在训练采精前，将发情母牛的分泌物涂于台牛尾部，以此刺激公牛性兴奋，要杜绝采用打骂等暴力行为对待公牛，以免抑制其性活动，无法正常调动公牛性兴奋。

3 冷冻精液科学的生产程序

3.1 前处理

3.1.1 种公牛和台牛的处理

种公牛在采精前要进行清洁消毒处理，防止精液受细菌等污染，影响精液质量。采精前用清水擦洗公牛下腹部，并用0.1%高锰酸钾溶液洗净包皮并擦干；台牛应选择大小适中，性情温和的健康母牛，洗净并消毒台牛后躯部、肛门、会阴、尾根等部位，将台牛固定在采精架内，拴好尾部。

3.1.2 器材的准备

采精所用的器材、设备等必须经过清洗和消毒处理。采精筒等塑料、橡胶用品每次用完后拆卸下来，先用洗洁精水清洗，然后用流动水冲洗干净，再用蒸馏水清洗，晾干后用75%酒精擦拭消毒，蒸发干后放于无菌操作台内，用紫外线消毒30min后备用。集精杯、试管、容量瓶、烧杯、试管、量筒、玻璃棒等玻璃器材先用洗洁精水浸泡后刷洗，然后用流动水冲洗，再用蒸馏水清洗后，晾干，用锡箔纸封口，放入干燥箱内，用干热消毒法，维持180℃，1h。纱布、工作服等物品采用高压蒸汽消毒，压力121磅，维持30min。配制的稀释液经0.22μm过滤器进行过滤消毒。

3.1.3 稀释液的配制

基础液Ⅰ液：蒸馏水100ml，柠檬酸钠2.97g，卵黄10ml；

基础液Ⅱ液：取第一液41.75ml，加入果糖2.5g，甘油7ml。

上述稀释液，每100ml加入青霉素、链霉素各5万～10万IU。

3.2 精液的采集

利用假阴道法，采用两次间隔爬跨法采集精液。采精时将公牛引至台牛后面，采精员站在台牛后部右侧，右手握持备好的假阴道。当公牛准备起步爬跨时，采精人员用左手取下盖假阴道入口的灭菌纱布；公牛爬跨后迅速用左手准确托握公牛包皮，将阴茎导入假阴道入口，使假阴道靠在台牛臀侧，随后公牛的后躯向前一冲即完成射精。当公牛滑下时，采精人员持假阴道随公牛滑下，迅速而自然地取下假阴道，将假阴道直立并重新盖上灭菌纱布。打开开关，放出空气和部分热水，以便精液完全流入集精杯内。然后取下集精杯，盖上集精杯盖，贴上标签后送入精液检查处理室。

3.3 精液的检测及稀释

从递精液窗口内将精液放入精液处理室。将精液倒入事先准备好的试管中，用胶头滴管在中间部位取出一滴放入载玻片上，盖上盖玻片在显微镜下镜检。利用密度仪和电子天平称量重量，输入精子活力值后，仪器会自动输出稀释倍数，根据数值进行稀释。一般鲜精活力在0.7以上，8亿/ml为合格新鲜精液。装有稀释液的瓶子放入盛有温水（35℃）的塑料杯中，防止温度变化过快，对精子打击后活力降低。

3.4 精液的分装

稀释后精液进行灌装、打印。将稀释后的精液轻轻摇匀后缓慢倒入塑料瓶中，灌装过程要检查打印是否清晰，封口是否完整，装管量是否合适，过少或过满都要挑选出来以废弃，分装过程要快，防止温度变化过快对精子的影响。

3.5 精液的平衡

分装好的细管精液放入4℃的冷柜中平衡4h。平衡可以使稀释液中的抗冻剂-甘油通过精子细胞膜进入细胞质内，使细胞内外达到离子平衡，使精子耐受低温冷冻。

3.6 精液的冷冻及保存

应用自动冷冻仪进行冷冻处理。将控制温度先输入电脑内，然后按照输入程序进行冷冻。-15～-50℃是精子受危害最大的温度区域，容易形成冰晶，对精子造成死亡。

当细管冷冻温度达到-140℃以后打开冷冻仪，取出细管冻精，用分装仪在液氮中将细管精液分装于25支小桶内，投入液氮灌中保存待检。

4 冷冻精液质量检测

4.1 活力检测

取两支和牛细管冷冻精液，37℃水浴中解冻，用吸水纸擦干细管上的水分，剪去封口端，把精液推入试管内并混匀，用移液器先后吸取混匀后精液10μl，两次分别放入两个载玻片上，盖上盖玻片后，在显微镜下观察活力，取两次活力平均值为待检批次精液活力值，冻解后活力值在0.35以上则为合格冷冻精液。

4.2 畸形率检测

取一支细管冷冻精液，37℃水浴中解冻，用吸水纸擦干细管上的水分，剪去封口端，把精液推入试管内并混匀，用移液器吸取混匀后精液10μl滴于洁净载玻片一端，用另一边缘光滑的凹玻片与载有精液样品的载玻片呈35℃夹角向前推，将样品均匀地涂于载玻片上，自然风干，同样制作两个抹片。在风干的抹片上滴1.0～2.0ml中性福尔马林固定液，固定15min后用清水缓慢冲掉固定液，然后自然风干。再将风干的抹片反扣在带染色板上，把姬姆萨液滴于槽和抹片之间，让其充满平槽并使抹片接触染液，1.5h后用清水缓慢冲去染液，晾干后放在显微镜下观察，每个抹片观察300个精子，观察时选取载玻片的中间部位，取两抹片观察的平均值，精子畸形率低于20%的精液为合格精液。

4.3 细菌数检测

取两支细管冷冻精液，37℃水浴中解冻，用吸水纸擦干细管上的水分。在超净工作台内点燃酒精灯，平皿盖上做好标记，用酒精棉球消毒整支细管，酒精灯下灼烧法消毒细管剪后，待剪降温后，剪去超声波封口端，将整支细管精液注入灭菌平皿内。及时将53℃水浴内的营养琼脂培养基注入平皿约10～15ml，并转动平皿混合均匀。同时，将营养基琼脂培养基倾入灭菌平皿内作空白对照，待琼脂凝固后，翻转平板，置37℃恒温培养箱内培养48h后立即计数。做平板菌落计数时，应在光线较强处，用肉眼观察，辅助放大镜观察，避免遗漏，可用菌落计数器计数。取两个平板菌落的平均数减去空白样板菌落数为待检精液每支细管菌落数，每支细管（0.25ml）精液培养菌落数大于1000个为不合格。

检验合格的冷冻细管精液才可用于生产。