钙蛋白酶抑制蛋白基因作为肉质候选基因的研究进展

陈冬金 陈岩锋 桑雷 孙世坤 王锦祥 谢喜平

（福建省农业科学院畜牧兽医研究所350013）

随着生活水平的提高，人们对畜禽肌肉品质要求越来越高，而影响畜禽肌肉品质的因素有很多，其中嫩度是一个很重要的评价指标。目前CAST基因被列入与畜禽肌肉嫩度有关的重要候选基因之一。

钙蛋白酶抑制蛋白（Calpastatin，CAST）是钙激活蛋白酶系统的内源性抑制蛋白，参与细胞信号传导、神经发育、机体肌肉生长等，其活性需要钙离子的激活。它可以通过识别被Ca2+激活后的钙蛋白酶的构象变化，并与之特异性结合，达到抑制蛋白酶活性的功效。通过调节钙蛋白酶和钙蛋白酶抑制蛋白的活性，影响畜禽肌肉的生长发育，也可参与肌肉生长中蛋白质的更新和抑制肌肉内蛋白质的降解[1]，提高肌肉嫩度，改善肉质。钙蛋白酶抑制蛋白通过确保钙蛋白酶对底物特定位点的水解抑制钙蛋白酶活性。

1 钙蛋白酶抑制蛋白结构特征

钙蛋白酶抑制蛋白于1964年被正式认定为钙蛋白酶系统的成员[2]，1979年被正式命名为钙蛋白酶抑制酶，1987年钙蛋白酶抑制蛋白首先被克隆出cDNA[3]。随后科学家成功地克隆与测序出多种不同的哺乳动物不同组织中CAST的cDNA[4]。比较不同物种的CASTcDNA序列发现其保守性较差，其蛋白由Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ5个结构域组成。第一个结构域Ⅰ（L结构域）功能研究还没有明确，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ结构域每个结构域都是由140个氨基酸残基组成，且相互之间具有20%～35%的氨基酸残基同源性，且这4个结构域均是由4个相似重复单位，并组成了CAST蛋白的活性中心[2]。每个重复单位含有A、B、C3个保守区，而发挥CAST抑制作用的关键部位可能是B区十分保守的七肽序列（Thr-Ile-Pro-Pro-X-Tyr-Arg）。CAST根据分子大小不同，功能性质相似的特点，可以分为主要存在于红细胞的70KD和主要存在于肝、心脏和其他组织中110KD两种类型。

2 基因定位及表达

CAST基因的定位和编码序列长度物种间存在差异。人的CAST基因定位于染色体5ql4-q22区段；牛的CAST基因定位于7号染色体上，其cDNA序列包含31个内含子和30个外显子；鸡和猪CAST基因都定位于2号染色体上，鸡的CAST的mRNA由30个内含子和31个外显子组成，全长为3551bp，而猪的CAST基因还发现品种间基因位点存在Rsal-RFLP和MspI，推测CAST基因是肌蛋白积累和肉质的一个候选基因。CAST基因表达的模式不同，如牛的该基因有4个启动子共同指导表达，且外显子可能遗漏、转录、翻译、翻译后水平等不同水平的调控，这对CAST基因发挥其抑制钙蛋白酶水解和与肉品质形成的作用中具有一定的生理学意义。

3 钙蛋白酶抑制蛋白的调节机理

钙蛋白酶抑制蛋白是一种需Ca2+激活的、内源性的钙蛋白酶抑制蛋白剂，可使肌肉内蛋白质降解受到抑制，肌细胞生长速度得以降低。该蛋白可在畜禽屠宰后对钙蛋白酶的活性起抑制作用，从而降低肌肉蛋白质的水解。钙蛋白酶与钙蛋白酶抑制蛋白的结合是可逆的，即有Ca2+时结合无Ca2+时分离。其抑制过程：首先是该蛋白的第2～5结构域中的A和C保守区，与钙蛋白酶的第4结构域与第6结构域紧密结合，然后B保守区与钙蛋酶的第2结构域结合而发挥抑制作用。根据该过程推测可以通过降低钙蛋白酶抑制蛋白的活性或激活钙蛋白酶来提高肌肉的嫩度来改善肉品质。

畜禽屠宰后，机体肌肉组织细胞中的肌浆网和线粒体外泄Ca2+增多，保留的Ca2+较少，Ca2+浓度的增加 （最终达到0.2mmol/L）使得肌原纤维中细丝的构象发现改变，促进细丝中肌动蛋白与肌原纤维粗丝中肌球蛋白的结合，从而导致屠宰后肌肉的收缩和僵硬。同时Ca2+浓度的增加也使钙蛋白酶的活性增强，促使肌节变短。屠宰后当溶酶体裂解后，组织蛋白酶被释放出来，并与钙蛋白酶作用一起使肌肉进一步嫩化继续。CAST的水平与畜禽屠宰后蛋白质水解的程度和速度相关，同时钙激活酶引起的钙激活酶抑制蛋白降解在调节影响肉质嫩化程度的蛋白质水解方面起着重要的作用。

4 CAST基因与肌肉生长及嫩度相关研究进展

4.1 牛CAST基因国外国内研究情况

Barendse（2002）[5]最早在对牛CAST基因3′非翻译区研究中，发现在2959处存在一个SNP位点（CAST-T1）。Morris（2006）[6]等用DdeI-PCR-RFLP分析该位点，且表明该位点对牛肉剪切力有显著影响。Casas（2006）等[7]分析该位点与肉品质的相关性，发现该位点的TT基因型与牛肉嫩度极显著相关（＜0.003），该位点与牛肉多汁性也显著相关。Schenkel（2006）等[8]研究发现，牛CAST基因第5内含子257bp处检测到一个SNP位点，且发现该位点CC基因型与牛肉剪切力有极显著相关。Eenennaam（2007）等[9]也发现该位点与牛肉剪切力、嫩度显著相关。Smith(2009)等[10]研究表明，该SNP位点与背最长CAST活性极显著相关（＜0.01），与牛肉剪切力显著相关（P＜0.05）。Reardon（2010）等[11]研究发现，该SNP位点与Irish杂交牛的pH和肉色有显著性相关。邓桂馨（2003）等[12]对牛CAST基因第6内含子研究发现，存在C/G突变，B等位优势基因，且BB基因型对牛肉嫩度有显著性的影响。H.Y.CHUNG(2000)[13]等研究发现，CAST基因型与CAST活性的相关性，以及在心脏、肾脂肪的分布都呈显著性差异。

4.2 猪CAST基因国外国内研究情况

Ciobanu等[14]（2004）研究表明，猪CAST基因与猪肉的蒸煮损失、系水力、多汁性均有显著性相关，但对pH的影响较小。Krzercio等[15]（2008）研究猪CAST基因第6内含子发现SNP位点，且该位点与各成熟期的猪肉蛋白含量及pH呈显著相关。K.Ropka-Molika等[16]（2014）分析CAST基因多态位点与肉品种相关，其中CAST/Rsal和CAST/Hpall对系水力影响最大，其次是肌内脂肪含量。孙立彬（2004）[17]分析了猪CAST基因型与肉质性状的相关性发现，CAST基因对脂肪含量有显著影响，同时还证明了CAST基因是可以作为肉质相关性状的候选基因。程丰等（2006）[18]研究发现，CAST基因对新荣昌Ⅰ系猪肉失水率有显著性的影响，CAST基因型与猪肉的嫩度存在相关性，CAST基因存在RasⅠ、MspⅠ、HinfⅠ等内切酶的酶切位点，为该基因作为猪肉嫩度的候选基因奠定基础。薛慧良（2008）等[19]共检测到猪CAST基因第24内含子A916G和C1633G两个SNP位点，将不同基因型个体进行比较，发现在屠宰45min后的pH有显著性差异。

4.3 其他动物CAST基因

燕凤等（2008）[20]研究绵羊CAST基因其表达量与背最长肌失水率有显著性负相关。Harper[21]等研究发现，钙蛋白酶抑制剂在胸肌中的含量增多会导致选育的生长种鸡比蛋鸡降解肌肉蛋白的速度慢，同时还发现肉鸡胸肌中的CAST表达量比本地鸡大，由于钙蛋白酶被激活后会引起蛋白降解，而CAST能抑制其活性，因此，CAST基因可作为影响肌肉生长的候选基因。除了上述多态位点，学者们还发现了其他与肉品质高度相关的变异位点。大量研究证实，CAST基因是研究肉质性状的候选基因，研究其突变会对研究肉品质有很大的作用。

5 小结

肉质性状主要指肉的风味、多汁性、嫩度和色泽等，其中嫩度影响肌肉品质的主要指标之一。影响畜禽肌肉嫩度的首要因素是肌肉中肌原纤维蛋白的降解程度，且CAST基因作为与嫩度相关性较大的肉质候选基因，所以可以通过基因技术调控CAST基因在肌肉组织中的表达量，调节肌原纤维蛋白质的降解，从分子水平上对肌肉生长和肌肉嫩度进行调控，从而达到提高畜禽肌肉生长和改善肉质的目的，这对提高畜禽的肉品质具有重要的意义。但具体的调控机理目前还不清晰，有待于进一步深入研究。