登革热疫苗最新研究进展

刘明磊，房恩岳，李玉华

综述

登革热疫苗最新研究进展

刘明磊*，房恩岳*，李玉华

目前，世界范围内登革热流行区在不断扩大，造成因登革病毒感染引起的住院和死亡人数不断增加[1]。研究估计每年约有 5840 万人感染登革病毒，造成大约 10 000 人死亡[2]。据 WHO 报道，登革病毒感染病例在过去 5 年内增加了 30 倍[3]。登革热病例的快速增长是由于全球运输、城市化进程加快以及气候变暖促进了伊蚊（登革病毒传播媒介）的传播[4]。登革病毒有 4 个血清型（DENV1 ~ DENV4），不同血清型之间氨基酸序列的同源性为 65% ~ 70%。感染某一种血清型的登革病毒引起的疾病严重程度不同，从无症状感染至症状较轻的登革热，还有严重的登革出血热和登革休克综合征[5]。

理论上，感染某种型别的登革病毒后，机体会产生对同型登革病毒的长期保护以及对异型登革病毒的短期保护作用。但是，也有学说认为抗体和 T 细胞产生的非保护性的免疫应答会加重另外一个型别的登革病毒的感染[6-8]。通过控制登革病毒的传播媒介防控登革病毒传播的技术尚不成熟[9]。研制和使用安全有效的疫苗是防控登革热最经济和有效的手段。赛诺菲巴斯德公司研制的黄热/登革嵌合减毒活疫苗 CYD-TDV[10]已在墨西哥、泰国、巴西、萨尔瓦多和哥斯达黎加等国家获批使用[11]。III 期临床试验显示疫苗在东南亚和拉丁美洲国家的整体保护效力分别为 56.7% 和 60.8%[12-13]。但是，在评价疫苗对 2 ~ 5 岁受试者的长期保护作用试验中，与对照组相比，接种疫苗后的第 3 年，受试者有更高比例的风险发生严重的登革病毒感染和住院治疗[10]。另外两种在研疫苗，日本武田制药公司（Takeda）的 DENVax 和美国变态反应与传染病研究所（NIAID）的 TV003/TV005 嵌合减毒活疫苗正在进行有效性试验。除此之外，中国的乙型脑炎/登革病毒 2 型（JEV/DENV-2）嵌合疫苗在非人灵长类动物的实验显示其具有良好的安全性和免疫原性[14]，其他 3 个血清型的嵌合病毒 JEV/DENV-1、JEV/DENV-3、JEV/DENV-4[15-16]也已经完成了临床前研究。为了及时掌握登革热疫苗最新研究进展，促进登革热疫苗的研发，本文就登革热疫苗的最新进展情况进行综述。

1 赛诺菲巴斯德公司研制的四价嵌合疫苗

赛诺菲巴斯德公司研制的四价登革热嵌合疫苗CYD-TDV（Dengvaxia），分别以 DENV-1、DENV-2、DENV-3、DENV-4 型病毒株的编码 PrM/E 蛋白基因替换用作疫苗生产株的黄热病毒 17D（YFV 17D）的相应基因获得YFV/DENV1-4 嵌合病毒减毒株[17]。临床前研究表明，CYD-TDV 的基因型和表型稳定。其嗜内脏性和神经毒力特性弱于作为骨架的 YFV 17D 疫苗，并且没有通过血液传播给蚊子的风险[18]。此外，体内预存的针对 YFV 病毒的免疫不会干扰 CYD-TDV 的使用[18-19]。

临床 IIb 和临床 III 期试验最能反映疫苗在人群中的实际效果，包括疫苗的效力，所以本文主要综述该疫苗的几次大规模的临床 IIb 和临床 III 期试验以及最近正在开展的一些临床试验结果。

在泰国进行的一次临床 IIb 期试验（CYD23）[20]，分为疫苗组和安慰剂对照组，共有年龄在 4 ~ 11 岁的 4002 名儿童参与试验，疫苗采用在 0、6、12 月接种3 针的免疫程序。试验结果显示，疫苗的整体保护效力为 30.2%。疫苗对不同血清型登革病毒的保护效果不同，对DENV-1、DENV-2、DENV-4的保护效力分别为 61.2%、81.9%、90.0%，而对DENV-2 的保护效力只有3.5%。尽管保护效果不同，在接种第 3 针后的 28 天，疫苗对 4 个血清型均有强的中和抗体应答。针对DENV-1、DENV-2、DENV-3、DENV-4 的中和抗体几何平均值分别为 146、310、405、155。接种人群对受试疫苗有很好的耐受，没有明显的安全问题[20]。体外测得的中和抗体水平和疫苗的保护效力之间的差异性给我们一些启示，即体内应答产生的中和抗体的质量、中和抗体型别的特异性或许都和疫苗的保护效果相关，并且仅有体液免疫应答或许不能抵抗疾病[21-22]。

随后在东南亚（CYD14）[12]和拉丁美洲（CYD15）[13]进行了两次大规模的临床 III 期试验。在东南亚，受试者接种 5.0 log10CCID50每种血清型的嵌合疫苗，与疫苗批准的注射剂量一致。该临床试验涉及 11 个地区，招募了年龄在 2 ~ 14 岁的 10 275 名青少年儿童。结果显示疫苗保护效力为 56.5%。与在泰国进行的登革热疫苗临床试验 CYD23 的结果类似，疫苗对不同登革病毒血清型的保护效力不同。对DENV-3（78.4%）和DENV-4（75.3%）的保护效力较高，对DENV-2的保护效力最低（35.0%），对DENV-1的保护效力处于中间值（50%）。疫苗对 12 ~ 14 岁青少年的保护效力（74.4%）高于6 ~ 11 岁（59.5%）和 2 ~ 5 岁（33.7%）的儿童。疫苗对之前感染过登革病毒而使个体血清基础免疫水平为阳性的儿童的保护效力（74.3%）明显高于血清基础免疫水平为阴性的儿童保护效力（35.5%）。尽管疫苗的保护效力不同，但针对 4 个血清型的登革病毒均产生了强的中和抗体。抗体的几何平均滴度，DENV-1 为 166，DENV-2 为 355，DENV-3 为 207，DENV-4 为 151。本次临床试验一个很好的结果是，CYD-TDV 疫苗表现出了对预防重症登革热很好的效力，预防严重登革热效力为 80.8%，预防登革出血热为 88.5%，预防登革热引起的住院治疗为 67.2%[12]。

在拉丁美洲，与在东南亚接种的疫苗剂量相同，受试者接种 5.0 log10CCID50每种血清型的嵌合疫苗。此试验涉及美国中南部的 22 个地区，招募了 20 869 名 9 ~ 16 岁的青少年儿童。结果显示，疫苗对受试者的整体保护效力为 60.8%，对登革病毒 4 个血清型的保护效力不同。对DENV-4的保护效力最高（77.7%），其次为DENV-3（74.0%），之后为DENV-1（50.3%），对DENV-2 的保护效力依然是最低的（42.3%）。中和抗体水平，DENV-2（574）和 DENV-3（508）较高，DENV-1（395）和 DENV-4（241）较低。与在东南亚进行的登革热疫苗临床试验 CYD14 类似，疫苗表现出了对预防重症登革热很好的效力，预防严重登革（95.5%），预防登革出血热（95.0%），预防登革热引起的住院治疗（80.3%）[13]。

在这两次 III 期临床试验中，对一种或几种登革病毒血清型抗体阳性的儿童中，有几乎 80% 的儿童，免疫 CYD-TDV 后的保护效力是登革病毒抗体阴性的儿童的2 倍（83.7% 对比 43.2%），该结果提示，疫苗保护效果主要来源于个体的登革病毒基础免疫水平而不是来源于疫苗接种[12-13]。

最近正在新加坡（NCT02824198）[23]和拉丁美洲国家（NCT02623725）[24]进行两个登革热疫苗临床试验，目的是评价受试者在疫苗免疫 3 针后，再加强免疫第 4 针的效果。在 HIV 感染的成人中进行的评价疫苗安全性和免疫原性的试验（NCT02741128）也正在进行中[25]。

2 美国变态反应与传染病研究所研制的 TV003/TV005 疫苗

尽管赛诺菲巴斯德公司的疫苗已经上市，其他研究者也在加紧研制登革热候选疫苗。美国变态反应与传染病研究所将病毒的 3' 端非编码区缺失一部分碱基，研制了预防 4 个病毒血清型的登革热疫苗 TV003/TV005。该疫苗病毒毒力减弱，同时也具有好的免疫效果。具体是将 DENV-1、DENV-3 和 DENV-4 病毒 3' 端分别缺失部分碱基获得减毒株。同时，以获得的 DENV-4 减毒株为骨架，用 DENV-2 编码 prM/E 蛋白的基因替换作为骨架的 DENV-4 病毒的相应基因获得 DENV4/2 嵌合减毒株[26]。根据上述策略构建的疫苗配方不同，分为两类登革热疫苗，将分别含有103 ± 0.5PFU 4 个登革病毒血清型的基因改造过的病毒混合配制，叫做 TV003[27-28]。将 DENV-2 型病毒含量提高为 104 ± 0.5PFU，其他 3 种 DENV病毒的配比与 TV003 保持一致的登革热疫苗命名为 TV005。因此TV003/TV005 含有DENV1-4 中的 DENV1、DENV3 和 DENV4 的病毒骨架，而登革病毒的骨架区能刺激机体产生 T 细胞免疫应答，或许此疫苗会具有更好的免疫原性和保护效力[1]。实际的研究结果也表明，该疫苗接种后不仅产生了中和抗体应答，也产生了 CD8+T 细胞应答[28-30]。

为了评价登革热疫苗 TV003 和 TV005 及其单针免疫和两针免疫疫苗效果的不同，进行了一次随机双盲、安慰剂作对照的 I 期临床试验[28]。在接种第 1 针疫苗之后，大约 60% 的受试者出现了轻微的皮疹，少部分受试者出现了轻微的嗜中性白血球减少症。在 TV003 和 TV005 组别中，76% 受试者检测到了持续 1 ~ 3 天低水平的病毒血症（< 1 log10PFU）。首次免疫后，针对DENV-1、DENV-2、DENV-3、DENV-4 的血清阳转率，TV003 组分别为 92%、76%、97%、100%，TV005 组分别为 92%、97%、97%、97%。二次免疫后，针对 DENV-1、DENV-2、DENV-3、DENV-4 的血清阳转率，TV003 组分别为 97%、94%、100%、100%，TV005 组分别为 94%、100%、100%、100%。对于机体产生的抗体滴度水平来说，与单次免疫相比，加强免疫一针后，TV003 和 TV005 组别抗体几何平均滴度的提升均不明显[28]。此试验结果表明，对此疫苗来说，加强免疫一针或许不是必须的。

为了评价 TV003 的免疫保护效力，采用了使用经基因改造过的、低毒力的 DENV-2 病毒攻击接种疫苗后的受试者，观察疫苗是否能保护机体免受此 DENV-2 病毒感染产生的病毒血症的发生以及是否出现皮疹、嗜中性粒细胞减少等不良反应[31]。试验结果显示，疫苗组的受试者均未出现病毒血症、皮疹、嗜中性粒细胞减少症，而安慰剂对照组出现了病毒血症和皮疹、嗜中性粒细胞减少症，说明 TV003 疫苗具有很好的保护效力[31]。目前此疫苗正在台湾进行 II 期临床试验（NCT03485144）[32]以及在巴西进行 III 期临床试验（NCT02406729）[33]。

3 武田制药公司的四价嵌合疫苗

日本武田制药公司的 DENVax，来自美国 CDC 和 Inviragen 公司联合研制的 DENVax 疫苗。通过传代减毒的方法获得了 DENV-2 减毒株 PDK-53，以之为骨架，分别用 DENV-1、DENV-3、DENV-4 的 prM/E 基因替换 DENV-2 减毒株 PDK-53 病毒相应基因，获得 DENV2/1、DENV2/3、DENV2/4 嵌合病毒[34]。此疫苗临床前研究显示了很好的疫苗病毒基因稳定性、安全性和免疫原性[35-37]。由于此四价登革热疫苗含有 DENV-2 的非结构蛋白，因此，该疫苗不但可以刺激机体产生针对登革病毒的体液免疫，也能诱导产生相应的细胞免疫应答。

在哥伦比亚做的一次随机双盲的 I 期临床试验中[38]，96 名 18 ~ 45 岁的受试者以两针法，皮下或者皮内免疫，第 1 针和第 2 针之间间隔 90 天。试验分为低剂量组和高剂量组。低剂量组 40 名受试者，接种的疫苗含有 DENV-1、DENV-2、DENV-3、DENV-4 的量分别为 8 × 103、5 × 103、1 × 104、2 × 105PFU。高剂量组的 36 名受试者，接种的疫苗含有 DENV-1、DENV-2、DENV-3、DENV-4 的量分别为2 × 104、5 × 104、1 × 105、3 × 105PFU。对照组接种安慰剂。受试者对该疫苗有很好的耐受，没有引起系统性的不良反应，仅有注射部位轻微的不良反应。对于皮下或皮内不同的注射方式以及低剂量或高剂量不同免疫方式的总体的结果是，62% 的受试者产生了对登革病毒4 个血清型的血清阳转，96% 的受试者产生了对登革病毒 3 个以上血清型的血清阳转[39]。

在美国进行了另一次 I 期临床试验[39]，受试者为72 名 18 ~ 45 岁未感染过黄病毒的中青年。试验为随机双盲，安慰剂组作对照组。试验也分为皮下和皮内的接种方式，分为低剂量组的和高剂量组，免疫两针，间隔 90 天，与在哥伦比亚进行的临床试验免疫方式一致。与哥伦比亚的临床试验结果一样，受试者对该疫苗能很好的耐受，没有产生系统性的不良反应，只是与安慰剂对照组相比，有更高比例的受试者出现了注射部位疼痛、红斑疹等不良反应。接种两针疫苗后，受试者对 DENV-1、DENV-2、DENV-3、DENV-4的血清阳转率分别为 84.2%、92.1%、86.8%、71.1%；产生的针对DENV-1、DENV-2、DENV-3、DENV-4 的抗体滴度分别为 54.1、292.8、32.3、15.0。高剂量免疫两针后，超过 90% 的受试者产生了针对 3 个以上登革病毒血清型的抗体应答[39]。

在完成了哥伦比亚和美国临床 I 期试验的基础上，在波多黎各、哥伦比亚、新加坡、泰国开展了临床 II 期试验[40]。试验分为两个阶段，研究疫苗对于成人和儿童的安全性和免疫原性。第一阶段选择 148 名年龄在 1.5 ~ 45 岁之间的志愿者，按照年龄递减分成 4 组。第二阶段是确定了疫苗在儿童中安全后才进行的，招募 212 名年龄在 1.5 ~ 11 岁的志愿者作为第 5 组。受试者分两次注射 DENVax 疫苗，含有DENV-1、DENV-2、DENV-3、DENV-4 的病毒量分别为 2 × 104、5 × 104、1 × 105、3 × 105PFU。受试者对该疫苗能很好的耐受，没有明显的全身性不良反应。然而，注射部位疼痛和红斑疹的发生率疫苗组要高于安慰剂对照组。多达 97% 的受试者在注射两剂疫苗后产生了针对4 个血清型登革病毒的血清阳转。针对 DENV-1 和 DENV-2 的抗体几何平均滴度较高，DENV-4 最低。5 个小组抗体滴度的变化范围 DENV-1 为 582 ~ 1187，DENV-2 为 582 ~ 1187，DENV-3 为 196 ~ 630，DENV-4 为 41 ~ 210[40]。

近期，评价该疫苗效力的一个大规模的临床 III 期试验正在进行中，同时登革热疫苗接种后引起的住院治疗和严重登革病毒感染症状的发生率（NCT02747927）[41]也将会被关注。

4 中国食品药品检定研究院和成都生物制品研究所联合研制的乙脑/登革四价（JEV/DENV1-4）嵌合活疫苗

乙型脑炎减毒疫苗株SA14-14-2 是中国食品药品检定研究院的俞永新院士及其带领的研究小组通过传代减毒方法获得的减毒株，以此疫苗株制备的乙型脑炎减毒活疫苗被广泛使用于中国和其他一些东南亚国家，具有很好的安全性和免疫原性。以其作为病毒骨架来研制嵌合登革热疫苗具有良好的前景。研究人员以疫苗株 SA14-14-2 为骨架，分别用 DENV-1、DENV-2、DENV-3、DENV-4 型病毒株的 PrM/E 基因替换乙脑病毒的相应基因获得 JEV/DENV1-4 嵌合病毒。已完成了临床前的安全性评价、免疫原性及工艺研究，正在向临床研究阶段推进[14-16]。

5 小结

最先上市的登革热疫苗CYD-TDV于 2015/2016 年获批在一些国家使用。然而几次大规模的临床试验（CYD23、CYD14、CYD15）结果显示其对 DENV-2 型的保护效力低于对其他血清型的保护效力。疫苗保护效果也依赖于机体针对登革病毒的基础免疫水平。对年龄小于9 岁儿童和未接触过登革病毒的人群保护效力偏低。并且年龄小于 9 岁儿童在接种疫苗后有住院治疗风险增加的危险。所以，仍需研制更好的登革热疫苗。另外两种嵌合疫苗，日本武田公司的 DENVax 和美国 NIAID 研制的 TV003/TV005疫苗也正在进行临床 III 期试验。DENVax 疫苗在 II 期临床试验中的总体效果不错，但是对 DENV-3、DENV-4 的保护效果低于 DENV-1 和 DENV-2。TV003/TV005 疫苗单剂量免疫后，在使用 1 株减毒不彻底的 DENV2 型病毒攻击来评价疫苗保护效力的试验中，疫苗组受试者均未出现皮疹、嗜中性粒细胞减少等不良反应，而对照组出现了这些不良反应的症状，说明此疫苗具有很好的免疫保护效力。此外，我国的研究人员以乙型脑炎减毒活疫苗病毒（JEV）为骨架，构建了 JEV/DENV1-4 四价嵌合减毒疫苗候选株。临床前的研究表明其具有很好的安全性和免疫原性，目前正在向临床研究阶段推进。

这几种疫苗均为减毒活疫苗，其中CYD-TDV 和 JEV/DENV1-4，均使用登革以外的另一种黄病毒做骨架获得嵌合登革病毒，CYD-TDV 是用黄热疫苗株YFV 17D 做嵌合病毒骨架，JEV/DENV1-4 是用乙型脑炎疫苗株SA14-14-2 做嵌合病毒骨架，所以，同CYD-TDV 一样，JEV/DENV1-4 也缺少 DENV 病毒骨架区，或许不能诱导产生针对 DENV 病毒的细胞免疫应答。JEV/DENV1-4 疫苗的下一步研究计划之一就是确定此疫苗包含的 JEV 病毒骨架是否能产生针对登革病毒的交叉反应性的细胞免疫应答。武田公司的DENVax 同为嵌合疫苗，不同之处在于，其采用一株减毒的 DENV-2 做病毒骨架，所以此疫苗包含DENV-2 病毒骨架区。而美国 NIAID 研制的 TV003/TV005，是使用基因重组技术，获得 DENV-1、DENV-3、DENV-4 减毒株，再以改造过的 DENV-4 减毒株为骨架获得 DENV4/2 嵌合减毒株，所以此疫苗为重组/嵌合活疫苗，包含了 4 种登革病毒血清型中的 3 种的病毒骨架。登革病毒骨架区可以刺激机体产生细胞因子应答，就这点而言，或许武田公司的 DENVax 和美国 NIAID 研制的 TV003/TV005 疫苗前景更好。

研制登革热疫苗面临着缺乏很好的动物模型，以及在登革热流行区人群对登革病毒的基础免疫水平存在差异等难题。此外，很多疫苗在临床前和早期的临床研究中以血清阳转率和中和抗体的水平作为评价疫苗免疫原性的指标，但是在后续的临床研究中却发现，注射疫苗后受试者产生了针对登革病毒某个型别很高的中和抗体水平，但是保护效果却不理想。有研究者认为，登革热疫苗的有效保护，不仅仅是依靠体液免疫，T 细胞免疫水平也发挥着重要的作用。

综上，登革热疫苗的研发虽然面临着一些困难，但是许多研究机构都在积极努力中，在登革病毒特点、登革热疫苗生产工艺、疫苗免疫效果评价以及疫苗的质量控制等方面都取得了不错的结果。可以预见，在不久的将来能研制出满足登革热控制需求的免疫效果好又安全的疫苗。

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102629 北京，中国食品药品检定研究院虫媒病毒疫苗室（刘明磊、房恩岳、李玉华）；130012 吉林，长春生物制品研究所有限责任公司（刘明磊）

李玉华，Email：liyuhua@nifdc.org.cn

2019-11-11

*同为第一作者

10.3969/j.issn.1673-713X.2019.06.012