可吸收止血材料效果评价方法

张爽，叶红，童琳，徐庆华

综述

可吸收止血材料效果评价方法

张爽，叶红，童琳，徐庆华

止血材料主要通过形成屏障来阻止血液流动，加速血液凝结要依靠纤维蛋白的产生[1]。可吸收止血材料是指可以被身体吸收的医疗产品，一般在手术过程中，传统止血技术无效，可以使用该类产品通过加速伤口的局部血液凝结过程来达到止血效果[2]。

该类产品的分类有：淀粉等植物多糖、氧化纤维素、再生氧化纤维素、可吸收性明胶、胶原等。伤口的大小和形态、出血的严重程度以及伤口的可及性都会影响止血材料的使用。理想止血材料应该具有快速止血、促进创面组织的修复愈合、无二次伤害以及价格低廉的特点[3]。临床证据表明止血产品确实能有效改善临床结果。

1 可吸收止血材料概述

1.1 纤维素类

纤维素类止血材料是由纤维素中的羟基与血浆中 Fe3+形成交联键，堵塞破损的毛细血管，进而达到止血目的，同时纤维素对血小板有黏附和聚集作用，可以激活体内凝血机制，加速凝血。纤维素类止血材料在 2 ~ 7 d 内逐渐被机体组织吸收，4 ~ 8 周内可完全降解，无异物反应[4]。纤维素类止血产品属于机械类止血材料，其特点是易用性较强，可以即刻使用，不需要特殊的储存条件；而且使用方法简便，医生直接将止血材料放在出血部位按压即可；除此之外还具有价格低廉、可抑菌的特点。纤维素类止血产品在市场中使用比重最大[1]。

1.2 纤维蛋白胶

纤维蛋白胶类是一种生物止血黏合剂，主要成分为纤维蛋白原（凝血因子 XIII、抑肽酶以及纤维结合蛋白）、凝血酶浓缩物。止血机制主要为：高浓度纤维蛋白原和凝血因子混合时，模拟体内凝血连锁反应的第三阶段，通过激活凝血，使纤维蛋白原逐渐聚合，最终形成纤维蛋白。通过在伤口表面形成纤维蛋白固化物蛋白膜附着在伤口上，最终达到止血效果[5]。

纤维蛋白胶具有粘接性能，便于结合分离的组织，减少了伤口的缝合操作，已被广泛用作手术密封和止血剂。同时纤维蛋白胶也具有良好的组织相容性，使用后可在短时间内降解吸收。但是由于组织黏附性差和机械强度低，其应用

受到限制。纤维蛋白胶的成本较高，并且存在患者过敏的情况[6]。

1.3 胶原蛋白和明胶

胶原蛋白是一种高分子生物纤维蛋白，是人体内最丰富的蛋白质（约占蛋白质总重量的 30%）。胶原蛋白在止血调节中的作用是可与凝血酶结合，刺激血小板，促进凝血因子的释放，也可诱导血小板聚集形成。胶原蛋白具有更好的生物相容性、生物降解性以及低免疫原性[7]。明胶大多是从哺乳动物或海洋动物加工处理而成，按其形态可分为明胶海绵、明胶粉末及明胶颗粒，大多数明胶止血材料与凝血酶合用可提升止血效果[8]。

1.4 壳聚糖

壳聚糖是一种天然的碱性多糖聚合物，可被人体吸收。壳聚糖具有良好的成膜性能、透气性和生物相容性。壳聚糖及其衍生物能增强血小板的黏附和聚集，促进血小板血栓形成，促进凝血效果。壳聚糖基具有内在的抗菌特性，可用于预防伤口感染，可以在受伤部位作为药物缓释载体释放生长因子，从而刺激和促进伤口愈合。通常情况主要通过壳聚糖改性或者其他复合材料来提高材料的止血性，例如壳聚糖氧化再生纤维素复合止血纱布、壳聚糖类人胶原蛋白海绵壳[9]。

1.5 淀粉类

淀粉是葡萄糖的高聚体，淀粉中还含有大量的羟基，亲水性良好。淀粉类止血材料在人体内降解时间短，能在人体内被组织液中的淀粉酶迅速降解为葡萄糖或麦芽糖，在体内能够完全吸收、代谢[10]。

2 止血效果评价

止血系统是一个较为复杂的生理过程，由体内的各种成分参与调节过程，普遍观点认为：血液中的凝血因子以无活性酶原形式存在，当某一凝血因子被激活后，可使许多凝血因子按一定的次序先后被激活，彼此之间有复杂的催化作用，这种机制被称作“瀑布学说”[11]。凝血机制在被激活后成指数增长，可吸收止血材料主要作用于创面伤口，通过激活内源性和外源性两条途径促进出血创面局部凝血，以及通过黏附血小板作用加速血小板聚集，促进局部凝血[12]。

2.1 体内止血效果评价

止血材料的止血效果常通过以下几个变量来表征：凝血时间、出血时间、出血量、全血浆凝块溶解时间、凝血酶原时间、活化部分凝血活酶时间[13]。

在体内止血效果评价中，一般会选用猪、兔子或大鼠作为实验动物，采用动物肝脏、股动脉、耳动脉出血模型模拟大出血的情况。在止血过程中，纤维素类材料的羧基能创造酸性环境并吸引血红蛋白中的Fe3+离子，形成凝块，加速凝血。Cheng 等[14]在评价氧化纤维素纳米晶体/藻酸盐复合膜材料实验中采用兔肝创伤模型，主要模拟出血较为严重的紧急情况，实验方法为将待测止血材料敷于出血创面，每30 秒记录止血时间和失血量，观察止血效果，止血时间和失血的体外评价表明，实验复合海绵具有优异的止血效率，并且在三周后可以完全生物降解，且没有炎症反应发生。Barba 等[15]采用大鼠股动脉止血实验，将大鼠的股动脉切开，用止血材料覆盖伤口，在没有压迫作用下，记录止血时间，并且在 7 d 和 14 d 观察存活率，结果显示止血材料可以在 90 s 内实现出血控制，大鼠存活率 100%。张自强等[16]通过建立大鼠肝脏出血创面，在肝脏创口内部植入胶原蛋白海绵材料，同时在肝脏切口表面外敷同款材料，记录出血量及止血时间并且在 7、14、28 d 进行肝脏创面组织学观察，结果显示实验组止血时间短于对照组。Ouyang等[17]在壳聚糖/罗非鱼肽复合海绵止血材料的研究中采用的是兔耳创伤止血以及股动脉模型。Dragostin 等[18]建立大鼠背部中度烧伤模型，取创伤部位组织进行 HE 染色，通过皮肤伤口穿刺活检和评估烧伤程度，判断材料的止血效果，结果显示止血材料愈合效果得到了改善。

2.2 体外止血效果评价

体外止血效果评价可以采用体外凝血实验、动态凝血实验、红细胞固定实验、血小板黏附实验、血小板吸附率实验。止血作用是血小板的主要生理功能之一，血小板能够通过黏附、聚集、释放及凝血等过程达到止血效果。血小板黏附率和聚集率的测定是血小板功能检测的基础，止血材料可以通过吸附红细胞及白细胞，聚集血小板，而达到快速止血的目的[13]。

Gu 等[19]采用体外凝血实验，评价明胶/壳聚糖纳米纤维复合材料的体外止血效果。本实验室体外凝血实验也是采用这种方法：用医用柠檬酸钠采血管抽取大鼠的新鲜血液，将待测样品加入 CaCl2后与全血溶液混合，反应后记录凝血时间。动态凝血实验采用大鼠全血，通过测量去离子水中血红蛋白在 540 nm 的吸光度数值。若去离子水中血红蛋白的量越高，则测量出的吸收度数值越高，表明红细胞固定在材料上的数量少，材料的止血效果越差；反之去离子水中血红蛋白的量越低，说明材料的止血效果较好，血液的凝结效果好。

以上的体外止血效果评价方法，都可以较为准确、快速地评价止血材料的体外止血效果。

3 生物降解性效果评价

理想的止血材料应具备体内可吸收性，防止在临床手术时，去除敷料造成二次出血的情况发生。

3.1 体外降解效果评价

刘白璐等[20]采用电导率法测定纤维素类止血材料的溶解度以及溶解速率，采用 DNS 法定量测定葡萄糖浓度。Li 等[21]采用的是电导率法以及 X 射线衍射法，对氧化再生纤维素缝合线的体外生物降解性进行分析。de Araújo Júnior等[22]认为扫描电子显微镜（SEM）、广角 X 射线衍射（WAXD）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）以及热重分析（TG）等方法都可以很好地鉴定氧化再生纤维素支架的特性。通过以上各种物理方法，可以对可吸收止血材料的体外降解效果进行较为直观的评价。

牛雯等[23]将止血粉直接注射到大鼠颅内或腹腔，经手术提取脑组织同质体或腹膜灌洗液上液，用碘-淀粉显色反应的标准曲线检测止血粉浓度，并且通过在大鼠脑、肝、肾、肺等不同组织中加入不同剂量的止血粉进行体外实验，孵化后检测止血粉剩余含量。动物体内含有的 α-淀粉酶，可以分解变性淀粉材料，最终生成麦芽糖、葡萄糖和糊精，参与到正常的新陈代谢。利用碘和淀粉的显色反应原理，以及在 610 nm 处用分光光度法定量测定吸收度峰值，可以较为准确地评价淀粉类止血材料的残留量。

蓝广芊[8]在壳聚糖/明胶复合止血材料的体外降解实验中采用的是生理盐水，模拟体液（SPF）溶菌酶溶液对止血材料进行体外降解测试。

3.2 体内降解效果评价

体内降解实验可以采用兔皮下降解、兔肌肉埋植降解、兔肝脏埋植降解三种方法。兔皮下埋植降解是模拟外科手术过程，止血材料残留在皮肤与肌肉之间的降解情况；兔背部肌肉埋植降解是模拟止血材料残留在肌肉时的降解情况；兔肝脏埋植生物材料降解是模拟止血材料残留在肝脏时的降解情况。具体实验步骤是将材料埋置于上述部位，组织切片进行 HE 染色，观察植入材料的降解情况[18]。

Cheng 等[14]将氧化纤维素纳米晶体/藻酸盐复合膜植入兔子后腿内侧肌肉，观察植入 7、14、21 d 后对兔子生理的影响。在植入待测材料后，记录实验动物的生理反应及植入部位的愈合情况；并且取出止血材料植入部位的组织后，进行 HE 染色，观察组织切片的病理情况。

4 抑菌性能评价

良好的止血材料应具有一定的抗菌性，以防止微生物及其他有害物质污染伤口。纤维素和壳聚糖止血材料具有抗菌特性。壳聚糖及其衍生物的抗菌机制可能是：①壳聚糖正电基团与细菌细胞壁上的负电基团之间的相互作用影响细菌细胞壁渗透性、导致细胞壁肽聚糖水解，抑制细菌生长；②壳聚糖在细菌周围形成聚合物，抑制细菌与外界的交换，阻碍细菌对营养物质的吸收。纤维素的抗菌机制是羧基降解后，产生的酸性环境具有抗菌作用[24]。

大多数止血材料实验将革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性菌大肠杆菌作为检测菌种，对止血材料进行抗菌活性的测定。本实验室采用的是贴膜法，对氧化再生纤维素类可吸收止血材料进行抑菌性能的评价。实验方法是将标准金黄色葡萄球菌、大肠杆菌传代培养，取浓度为 1.5 × 108CFU/ml 的菌液，滴在可吸收止血材料和对照组表面，将培养的样品上覆盖的 PE 膜置于试管中，将处理过的菌液接种于营养琼脂培养基（NA）中，用涂棒涂抹均匀，培养 24 h 后计数菌落数（CFU）。这种方法主要用于纤维素类、壳聚糖类可以制成膜状的止血材料的抑菌性能的评价。

Archana 等[25]采用的是琼脂扩散法，测试壳聚糖/纳米氧化银材料的抑菌作用。Dragostin 等[18]也采用琼脂扩散法对壳聚糖衍生物材料的最低抑菌浓度（MICs）和最低杀菌浓度（MBCs）进行了测定。罗旭[26]参考国标 GB/T 20944.3-2008 中的振荡法，将培养好的菌种在 LB 培养基中稀释至约 1.5 × 105CFU/ml，将止血材料放入 6 孔细胞培养板中，然后向每个孔中加入菌液，培养完成后，用酶标仪读取各孔在 600 nm 处的吸光度进行抗菌性能测试。刘文迎[27]采用的是混平板法和纸片扩散法对止血材料的抗菌性能进行测试。在混平板法，所有培养皿在培养箱中集中培养，观察菌落生长情况。纸片法是将含有测试液的滤纸放在培养基中，从而测量抑菌带的直径。以上的抑菌性能的评价实验结果真实可靠，方法简便且重复率高，有利于快速检测出产品的抑菌性能，方便把控产品质量。

5 小结

根据国家食品药品监督管理局颁布的《可吸收止血产品注册技术审查指导原则》，该类产品应申报止血原理，生物吸收和降解特性等性能指标，以及制定依据[2]。国内的止血材料的研发还处于起步阶段，虽然市场上有不少优秀的止血材料，但是与起步较早的国外产品相比，还是具有一定的缺陷。目前市场上可吸收止血产品种类繁多，但没有专业权威的评价标准，本文希望通过对可吸收止血材料效果评价方法的综述，掌握主要实验方法，为今后的可吸收止血材料的开发以及临床前的研究提供一定的参考。

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安徽省卫计委科研课题（2018YK002）

230061合肥，安徽省医学科学研究院预防医学研究所

徐庆华，Email：xqh1126@sina.com

2019-07-16

10.3969/j.issn.1673-713X.2019.06.016