齐墩果酸新对肝癌的抑制作用研究进展

2019-01-05王海珠万明霞刘馨泽张璟祎王浩天

中国实验诊断学 2019年8期

苏雨，王海珠,杨彬,万明霞,刘馨泽,张璟祎,王浩天

(吉林大学药学院，吉林长春130021)

肝癌是病死率最高的恶性肿瘤之一。我国大约3亿人患有肝脏疾病，每年约有38.3万人死于肝癌,占全球肝癌死亡病例数的51%,严峻的形势给我国的社会和医疗带来了沉重的负担。齐墩果酸(oleanolicacid，OA)是以游离形式广泛存在于草本植物中，如女贞子，西洋参，连翘，三七，人参等的五环三萜类化合物。该药在20世纪70年代就开始用于治疗肝炎。近年来，更有研究表明，OA能够抑制恶性肿瘤如肝癌[1]、肺癌[2]等的生长有良好的作用，但其分子生物学作用机制尚不明确，现从细胞分子的层面上将肝癌的发病机制及特性，齐墩果酸的特性及其抑制肝癌机制综述如下。

1 肝癌的发病机制

迄今为止，肝癌的致病原因尚待研究。目前认为肝癌的发生是由病毒性特异因子、免疫机制、环境因素和个体遗传背景相关基因共同作用的结果。

在我国，HBV、HCV或二者双重感染会显著增加患肝癌的几率。其中乙型病毒蛋白HBx可能通过调节氧化应激、DNA修复、信号转导、转录、蛋白质降解、细胞周期进程和细胞凋亡相关信号通路的调节，从而在病毒诱导的肝细胞癌中起重要作用[3]。另有基因测序技术表明肝癌细胞中，HBV DNA整合位点与易感基因/单核苷酸多态性也对肝癌由重要作用[4]。在西方，HCV诱导慢性炎症进而促进肝癌发展，这一过程中包含了持续性慢性肝炎及纤维化、不可逆的遗传改变以及恶性克隆[5]。

近年来有研究发现，肥胖、糖尿病及其代谢综合征会引起非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)，NAFLD可能在炎症因子、氧化应激、信号通路的激活及抑癌因素的减少的情况下发展成肝癌，但具体机制尚未明确，可能通过诱导肝脏的胰岛素抵抗及多种促炎性细胞因子(如TNF-α、IL-6)、血管活性因子及促氧化分子的释放来导致肝癌的发生和发展，也需进一步的研究加以证实[6]。肝癌的发展与Hh的同源基因Shh信号通路激活后，增加细胞因子B1与周期依赖性蛋白激酶CDK1蛋白表达，进而明显促进肝癌细胞的增殖[7]。异常激活细胞外信号调节蛋白激酶ERK使其磷酸化，激活靶分子c-Fos等[8]或异常激活c-Jun N末端蛋白激酶JNK信号通路引起下游通路蛋白P53等表达，从而促进肝癌增殖及血管生成，参加调控肝癌细胞的周期与凋亡进程[9]。还有Notch信号通路作为多信号通路的交点，与TGF-β和NF-κB间接作用，在肿瘤细胞的增殖、成长、凋亡、迁徙、侵袭及血管生成中也其重要作用[10]。

2 肝癌的异质性和特性

肿瘤异质性是恶性肿瘤广泛存在的特性之一，其中肝癌异质性最为明显。诸多研究表明肿瘤异质性这一重要特征在肝癌的发生、发展中起重要作用[11]。

现在普遍认为肿瘤异质性的发生机理主要有克隆进化模型和肿瘤干细胞模型两种。第一种为在正常细胞向肿瘤细胞转变这一阶段，基因多次突变，造成基因型多样性与表型上的改变，从而导致肿瘤异质性。第二种则认为肿瘤干细胞分化产生不同克隆的肿瘤细胞亚群，二者相互形成动态作用造成肿瘤异质性。

目前多认为肝细胞癌多中心发生或原发癌的转移可以显示出显著的肝癌异质性。通过累积不同基因的改变而形成肝癌的多发生中心，Miao等多研究发现在转移灶内发现大量的相似的突变型基因[12]，有相似的基因谱，展现了肝癌的异质性[13]。上面我们提到肿瘤干细胞，研究发现具备干细胞表型的肝癌亚型预后差,难以用统一的标准进行界定。Tang[14]、Yamashita[15]等实验发现不同类型表达的肝癌细胞具有不同的生物学行为，例如能促进血管生成和肿瘤起始能力；或具有细胞内皮特性易于细胞转移；或赋予细胞耐药特性，这些也影响了肝癌的异质性。

3 齐墩果酸的生物学特性

齐墩果酸是一种天然五环三萜酸类化合物，广泛存在与蔬菜、水果、草药当中，是最为常用的天然生物活性成分。在几十年前被我国批准用来作为保肝药以及肿瘤病人的免疫调节剂。大量研究表明齐墩果酸有广泛的生物活性及药理作用，包括抗炎、抗动脉粥样硬化、抗糖尿病、保肝、抗骨质疏松等，其中最为有发展空间的实数它的抗肿瘤功效[16]。

齐墩果酸作为重要的植物提取物，已有实验探讨了以肝癌[17]、白血病[18]、肺癌[19]为研究对象的试验中验证了其具有克制肿瘤生长的效应。通过抑制肿瘤生长三个阶段的相关通路及基因，主要体现在抑制肿瘤细胞增殖[20]、诱导肿瘤细胞凋亡[21]、抑制肿瘤新生血管形成[22]、抑制肿瘤细胞侵袭[23]以及逆转肿瘤细胞及促进肿瘤细胞分化[24]的作用。

4 齐墩果酸对肝癌的抑制作用

4.1 抗侵袭和抗转移作用

肿瘤侵袭是肿瘤细胞脱离原发部位，穿透基底膜，向周围组织浸入生长的过程。肿瘤转移是肿瘤细胞通过毛细血管和淋巴管移动，离开肿瘤原发灶或继发灶，形成新的肿瘤的过程，肿瘤的转移也可以看成肿瘤侵袭的进一步发展。肿瘤的侵袭和转移是一个复杂、受多个影响因素控制的过程，任何参与调控的基因和涉及到的步骤发生改变，都有可能对侵袭和转移产生影响。

在Chun-Che Lin 的报道[25]中指出OA 可以影响肝癌细胞株Hep3B、Huh7 和 HA22T的浸润和迁移。还有研究表明，齐墩果酸对PGCL3细胞穿膜侵袭能力有显著抑制作用，PGCL3细胞的穿膜运动能力和粘附能力，也均有显著下降，其中OA是通过对黏附、运动、降解等多个侵袭作用的机理产生抑制，而不是在某一单一路径产生抑制[26]。另一实验进一步证实了QA对PCCL3细胞侵袭和转移的抑制作用，并认为其抗转移和侵袭机制是促进肿瘤细胞表型分化，从而使参与侵袭转移的蛋白酶产生减少，控制肿瘤细胞的侵袭和转移，同时抑制了新生血管的产生[27]。肿瘤能够诱导新生血管的形成而具有丰富的血管，其生长、侵袭和转移都依赖血管作为体内的主要渠道来供给氧气和营养物质，因而肿瘤的侵袭和迁移依赖肿瘤血管的生成，因此，抑制肿瘤的侵袭和迁移的核心为抑制肿瘤血管的生成。

4.2 抑制新生血管

目前研究表明肿瘤的生长、侵袭和转移过程都依赖血管作为体内的主要渠道来供给氧气和营养物质，而血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)是调节血管形成的主要细胞因子。VEGF是高度保守的同源二聚体糖蛋白，部分能作用于血管内皮细胞促进血管内皮细胞增殖，增加血管通透性。在正常生理条件下，VEGF作用于其特异性受体后，引起多个信号反应，促进血管增生。在低氧环境下，肿瘤分泌大量的VEGF，VEGF通过提高血浆酶原活化因子(PA)和血浆酶原活化因子抑制因子-l(PAI-1)的mRNA表达，来提高血浆酶原活化因子的活性，促进细胞外蛋白水解，进而促进新生毛细血管的形成。肿瘤内高浓度的VEGF能够使血管的通透性增加，增加肿瘤细胞的侵袭能力[28]。有研究表明OA通过抑制VEGF在肝癌中的表达，降低VEGF的水平，从而发挥抑制肿瘤生长的作用。

4.3 调节信号通路，对细胞凋亡的影响

4.3.1Bax基因通路机制 Bax为促凋亡基因，归类为Bcl-2基因家族，能构成同源二聚体加速凋亡或异源二聚体克制细胞凋亡，通过二者的比例变化来影响细胞的凋亡[29]。当细胞接收到凋亡信号后，bax表达增加，作用表现在两个方面：①与bcl-2形成同源二聚体加速凋亡；②同bcl-2结合成异源二聚体，降低bcl-2在细胞中的浓度，拮抗bcl-2的抑制凋亡作用。Bax基因表达的蛋白位于caspase3蛋白激活的上游，他将凋亡信号传递给下游的Caspase3，促使Caspase家族信号放大，最终诱导细胞凋亡[30]。Bax 是细胞线粒体凋亡通路的重要组成成员，与Bcl-2协同引起线粒体膜通透性改变，使跨膜电位消失，并释放Cytochrome C，Cytochrome C和凋亡蛋白酶活化因子构成多聚复合体Apaf-1，又透过Apaf-1氨基端的Caspase聚集结构域使胞质中的Caspase-9 前体聚集，激活Caspase 级联反应，激活下游Caspase-3 和 Caspase-7，完成其相应底物的剪切，引起细胞凋亡[31]。

4.3.2影响caspase 3表达肿瘤的发生不仅是细胞增殖的异常，细胞凋亡通路也发生了改变，其中凋亡相关基因发挥了重要作用[32]。Caspase家族全称为含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶，是一组存在于细胞质中结构上相关的半胱氨酸蛋白酶[33]。

Caspase 3是Caspase家族中参与细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶，分布于各种类型的细胞中[34]。Caspase 3主要是通过Fas/TNFR1介导的死亡受体途径和线粒体途径两条通路介导细胞凋亡[35]。Caspase 3底物主要是多聚(ADP-核糖)聚合酶PARP(poly(ADP-ribose) polymerase)，也可参与U1-70K、DNA-PK、PKCd 和PKCq等底物的切割。Caspase 3活化后直接参与切割细胞中相应底物的多种蛋白,最终导致细胞的程序性死亡[36]。

4.3.3抑制bcl-2通路机制 B淋巴细胞瘤-2基因简称bcl-2，Bcl-2基因是一种癌基因，它具有抑制凋亡的作用，BCL-2是最早发现的细胞死亡调节BCL-2蛋白家族的成员之一[37]。它与许多的癌症类型，以及一些精神疾病和自身免疫性疾病有关。在癌症中，BCL-2可阻止一些细胞(包括淋巴细胞)凋亡。

通路机制：①细胞发生凋亡的一个诱因证实可能为活性氧损伤造成但bcl-2的过表达可减少纸质过氧化物和氧自由基的形成[38]；②推测bcl2可能参与抑制钙离子跨膜运输；③bcl2蛋白在凋亡发生过程中表现为离子通道蛋白和锚定蛋白存在[39]。

本课题组在前期研究中发现，OA对肝癌模型动物肿瘤组织中Bax、bcl-2、caspase 3的表达具有一定的影响，对肿瘤的增殖和转移具有一定的抑制作用，并呈剂量依赖，已有研究也已证实了OA可上调多种肿瘤组织中以上基因的表达有一定的影响。

4.4 诱导细胞周期阻滞

细胞周期(cell cycle)是指细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结束所经历的全过程，分为间期与分裂期两个阶段，与肿瘤细胞的增长有密切关系。有研究表明齐墩果酸可以使肝癌细胞Hep3B细胞周期在G2/M期产生阻滞[40]。此外，还有一项关于骨肉瘤细胞的研究发现，OA可以使大量骨肉瘤细胞阻滞于G1期，这一过程是通过抑制G1到S期转变的关键靶点cyclin D1而实现的[41]。细胞周期是受到多个调控因子和多个检测点严密调控的，是一个有序而精确的过程，当这些调控因子和检测点功能发生紊乱时，就会导致肿瘤的发生发展[42]。

4.5 OA对线粒体损伤及细胞内Ca2+水平的调节作用

线粒体是目前公认的最普遍的凋亡机制，一旦凋亡信号形成就会激发细胞质内Bal-2等促凋亡蛋白的形成，这些凋亡因子会转移到线粒体进而诱导线粒体膜间质凋亡蛋白、细胞色素C的释放。Ca2+水平是机体维持功能的重要因素。在正常生理状态下,Ca2+在内质网内的水平高，一旦机体出现异常，细胞质内Ca2+水平激增并进入线粒体内部，促进细胞色素C的释放或活化caspase-12前体，从而激活caspase-9，启动凋亡程序。