CREB转录因子磷酸化信号通路与癫痫的研究进展

吕晓民，朱战鹏， 孙立超

(吉林大学第一医院 1.神经内科;2.急诊内科，吉林 长春130021)

癫痫为神经系统常见疾病，尽管近年来多种抗癫痫药物迅猛发展，但仍有30%-40%的癫痫患者对药物反应差，可并发记忆力损伤、癫痫猝死、自杀等严重并发症，为药物难治性癫痫[1]。因此需进一步加强癫痫的发病机制研究。癫痫发病机制涉及离子通道、信号转导、突触与缝隙连接、遗传、自身免疫、炎症反应等多种因素[2-6]。这些因素并非孤立，彼此联系十分密切。近年来研究表明环腺苷酸反应元件结合蛋白(cAMP response element binding protein，CREB)磷酸化信号通路在癫痫发病机制中发挥重要作用，现将研究进展做一综述，同时癫痫新药开发提供理论支持。

1 CREB分子生物学特点

Montrminy于1986年报道许多基因启动子含高度保守8碱基回文序列5′-TGACGTCA-3′，且受cAMP的调节，称之为cAMP反应元件( cAMP response element,CRE)[7]。Yamamoto于1988年发现一种分子量为43000的转录因子，与CRE结合后使基因转录增强，称之为cAMP反应元件结合蛋白，简称CREB[8]。CREB由 341 位氨基酸残基构成，C端为天冬氨酸，N端为蛋氨酸。其中碱性亮氨酸拉链区、激酶诱导结构域区、α区为CREB行使转录因子功能的重要区域。CREB属转录因子亮氨酸拉链家族中的一员，C端的第277-341位氨基酸残基肽段富含大量碱性氨基酸，且亮氨酸重复出现，称为碱性亮氨酸拉链(basic leucinezipper，bZIP)，该部位与DNA亲和力高，为CREB与启动子CRE位点想结合的部位。CREB以同源或异源二聚体形式与CRE结合。CREB分子N端第98位至第144位氨基酸残基的肽段，含有多种蛋白激酶对CREB进行磷酸化的位点，称为激酶诱导结构域区(kinase inducible domain，KID)，这些激酶包括蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)、酪蛋白激酶Ⅱ(Casein KinaseII，CKII)和钙-钙调素激酶IV(Ca2+/calmodulin dependent kinases IV，CaMKIV)等。上述激酶识别CREB Ser133位点，将其磷酸化形成pCREB而上调转录。其他位点Serl42和Serl43磷酸化抑制CREB的转录活性。此外含大量脯氨酸的PRO区将bZIP区与KID区分离，目的是使两个区域更好地发挥其作用。α区是第88位至第101位氨基酸残基的肽段，呈α螺旋结构，缺乏这一段序列的CREB分子简称为CREBΔα，其调节转录活性较CREB明显降低，α区是CREB的转录功能调节的必需片段。

CREB以去磷酸化形式存在于细胞核中，此时无活性。目前发现多个信号通路途径参与CREB的激活。目前以AC-cAMP-CREB信号通路研究最为广泛。细胞膜上G蛋白耦联受体与单胺类递质结合后激活腺苷酸环化酶(adenylylcyclase，AC)，使细胞内cAMP水平升高，cAMP激活PKA，将CREB Ser133磷酸化形成pCREB。CREB结合蛋白 (CREB binding protein，CBP)为核因子，与pCREB结合形成复合物后才能与靶基因CRE相结合调控转录[9]。其他通路还包括Ca2+-CaMKIV-CREB信号通路、MAPK-CREB信号通路及PI3-Akt-CREB信号通路等。蛋白磷酸酶P1(proteinphosphatase,PP1)与蛋白磷酸酶P2A(proteinphosphatase,PP2A)可以使pCREB去磷酸化则下调其转录活性[10]。

CREB是通过磷酸化与去磷酸化的形式来实现其调节细胞转录功能。目前研究表明，CREB磷酸化信号通路与细胞生长、增殖、分化、周期调控以及学习记忆密切相关。同时CREB能调控基因转录而改变细胞兴奋性及调节突触可塑性，因此CREB可能参与癫痫发病机制。

2 CREB与异常突触

大量病理证实，癫痫反复发作可以导致异常树突形成、苔藓纤维出芽、神经元坏死、胶质细胞增生、局部慢性炎症等，同时形成异常兴奋性环路构成异常突触，从而进一步促进癫痫的发展。研究表明CREB与树突的生长发育、苔藓纤维出芽密切相关。Finsterwald等报道CREB与CREB调控的转录共激活因子1(CREB-regulated transcription coactivator，CRTC1)共同介导脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)对树突发育的调控，抑制CREB活性后将消除BDNF对树突长度及侧枝形成的促进作用[11]。Redmond等研究表明钙离子诱导的树突生长受CaMKIV与CREB的活性调控。钙离子内流将激活CaMKIV，CREB为CaMKIV的底物，将其Ser133磷酸化形pCREB，进一步调控基因转录合成蛋白质，改变神经元细胞骨架结构，同时调控与树突相关蛋白质合成促进树突生长[12]。Li等发现CREB协同因子1(transducers of regulatedCREB，TORC1) 与CREB共同调控神经元树突生长。磷酸化的TORC1无活性，其活性受钙离子及cAMP调节。当钙离子通过电压门控钙离子通道内流时，激活钙调神经磷酸酶( calcineurin，CN)，磷酸化的TORC1在CN作用下去磷酸化而激活。应用TORC1抑制剂或者下调TORC1时，在体内及体外均发现树突生长受到抑制[13]。因此CREB上调会促进靶基因转录，进而导致神经元局部细胞骨架肌动蛋白合成增加形成苔藓纤维出芽、异常突触及异常神经环路，导致抗癫痫药物失效而形成难治性癫痫。

3 癫痫使CREB表达增强

多项研究表明癫痫动物模型及患者脑组织的CREB表达较正常脑组织明显增强。Zhu报道了匹罗卡品诱导癫痫小鼠，发作3天后海马CREB及pCREB水平较对照组明显增高，且持续8周[14]。Guo报道了30例难治性颞叶癫痫患者，均行3种及以上抗癫痫药物治疗无效而行外科手术治疗，其对照组为既往无癫痫及其他神经系统疾病的外伤患者，结果表明TLE组颞叶新皮层pCREB表达较对照组明显增强[15]。Beaumont等研究表明在新皮层癫痫，pCREB及其靶基因均呈现出层特异性分布。CREB于各层均有表达，但pCREB仅在II层(外颗粒层)及III层(外锥体细胞层)表达。靶基因的表达分成两种类型[16]。ARC、EGR1与pCREB相同仅限于II、III层中表达。然而EGR3与NARP，其表达扩展到更深层，不限于II、III层，但其表达在II、III层最多。其中EGR1基因与人类新皮层癫痫发作间期棘波频率密切相关[17]。这种层特异性的蛋白及基因的表达可能为癫痫的病理基础。由以上研究表明CREB转录因子磷酸化信号通路参与癫痫的发病机制。

4 CREB活性与癫痫

癫痫发作后CREB上调及CREB对海马神经元兴奋性调节，表明CREB可促进癫痫发生及发展。Armentia等研究表明当CREB磷酸化而激活时，会抑制后超极化(afterhyperpolarization，AHP)电流，使持续表达CREB转基因小鼠海马CA1 神经元活性增强，甚至出现散发癫痫样放电[18]。Zhu等利用CREB Ser133突变成Ala133的CREBIR与CREBΔα转基因小鼠诱导癫痫持续状态及慢性癫痫模型，研究发现抑制CREB活性将缩短癫痫持续状态持续时间，同时减少慢性癫痫发作的次数，但不能缩短慢性癫痫发作持续时间[19,20]。

5 CREB靶基因与癫痫

启动子含有CRE的基因为CREB靶基因。目前发现多种CREB靶基因与癫痫密切相关，如α1-GABAA、BDNF、COX-2与NMDA等。Hansen一项研究表明在癫痫持续状态及慢性癫痫中，CREB靶基因表达明显增强[21]。

5.1 α1-GABAAγ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)为中枢神经系统主要的抑制性神经递质，其受体分为GABAA、GABAB、GABAC三种。GABA能神经递质传递减少被认为是人类癫痫发生的病理生理机制之一。GABA主要作用于GABAA受体，其由多个亚基构成(α1-6，β1-3，γ1-3，δ，ε，π，θ，ρ1-3)。该受体是配基门控氯离子通道受体，其氯离子电导率受GABAA受体结合因子如地西泮等的调解。编码GABAA受体α1亚单位的基因α1-GABAA位于5号染色体，为CREB靶基因[22]。Lund等应用染色质免疫共沉淀技术(Chromatin Immunoprecipitation，ChIP)发现癫痫持续状态小鼠齿状回pCREB与内源性α1-GABAA结合增强[23]。Hu等发现CREB的过表达会显著抑制α1-GABAA活性。上述研究表明CREB为α1亚单位表达的重要调节因子[24]。

5.2 BDNF脑源性神经营养因子BDNF除参与神经生长、分化过程外，还调节神经突触传递，其受体为酪氨酸受体激酶B(tyrosine receptor kinase B，TrkB)。当BDNF与TrkB结合时。TrkB受体激活能使神经元快速去极化，加强兴奋性突触传递、降低抑制性突触传递，使神经网络高度持续兴奋，为构成癫痫发作的病理基础。研究表明BDNF与CREB相互作用，即BDNF激活CREB转录，反过来CREB与BDNF基因的CRE结合促进其转录[25,26]。Zhu等的研究发现含有CREBΔα转基因小鼠匹罗卡品诱发癫痫持续状态后48小时，其海马部位BDNFexon IV mRNA较对照组表达下降[19]。

5.3 COX-2环氧化酶2(Cyclooxygenase，COX-2)是花生四烯酸代谢过程中前列腺素(prostaglandins，PGs)合成的限速酶。人类COX-2 基因定位于1号染色体的1q25.2-q25.3,全长8.3kb，由10个外显子和9个内含子构成，编码604个氨基酸残基组成的多肽。在5′端转录起始点上游含一些转录调控序列，如NF-κB位点、TATA box、CRE等。目前认为COX-2与炎症、肿瘤等密切相关，因诸多炎症介质参与癫痫发病过程，因此认为炎症反应为癫痫发生发展的重要因素之一[27]。Lee等研究发现，在含有CREB抑制基因A-CREB的转基因小鼠癫痫持续状态模型中，COX-2的表达减弱，表明CREB可诱导COX-2的表达[28]。

5.4 NMDA谷氨酸为神经系统重要的兴奋性神经递质，其受体主要可以分为两大类：

N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartic acid receptor,NMDA)与α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid receptor,AMPA受体)。NMDA受体为谷氨酸主要受体。目前研究认为神经系统兴奋性递质与抑制性递质失衡是癫痫发病机制之一。在癫痫发作中，NMDA受体含量增多，表达升高，谷氨酸与NMDA结合后钙离子通道开放，钙离子内流导致神经元兴奋性增加产生癫痫样放电。NMDA受体是一种分布在突触后膜上的离子通道蛋白，是一种异聚体，由NR1、NR2、NR3 3种亚基组成，每个受体至少由2个NR1亚基和2个NR2亚基组成。NR2亚基分为NR2A、NR2B、NR2C、NR2D 4种亚型，其中NR2B与学习记忆、疼痛等密切相关。NR2B基因含800个碱基对，5′端406-413位点的碱基对为CRE[29,30]。Rani研究发现CREB激活形成pCREB可以使小鼠神经元NR2B上调[31]。

癫痫发病机制复杂，但CREB是否直接参与目前尚不明确。做为细胞核内转录因子的CREB在诸多细胞传导通路的激活下，调节细胞的转录水平，调控突触可塑性及细胞兴奋性。因此抑制CREB活性的策略可能对于治疗癫痫有效。随着 CREB 研究的深入，其不仅可能成为癫痫诊断、筛查、预后的重要标志物，同时也有可能成为癫痫新药物个体化治疗的新靶点。