TSP家族蛋白在癫痫发病机制中的作用研究进展

王耀辉 陈 涛 余思逊 匡永勤 树海峰△

1)西部战区总医院神经外科，四川 成都 610031 2)西南交通大学临床医学院，四川 成都 610031

癫痫是神经系统常见疾病，其发生的病因、发病机制及如何控制尚未完全阐明。许多中枢神经系统疾病，如中枢神经系统创伤、肿瘤、感染、退行性病变、血管病变等常继发性引起癫痫。在细胞水平上，癫痫的发生与星形胶质细胞密切相关[1]。近年来就星形胶质细胞及其分泌的细胞外基质蛋白凝血酶敏感蛋白(thrombospondins，TSP)在癫痫发生中的重要作用研究为我们认识癫痫提供了新的重要方向。TSP与其受体α2δ结合可诱导中枢神经系统兴奋性突触数量上调，引起兴奋性突触与抑制性突触结构和功能失衡，导致神经元过度兴奋[2]，引起癫痫发生。本文就TSP、α2δ受体在中枢突触生成中的作用和TSP拮抗剂加巴喷丁、普瑞巴林抑制癫痫症状的作用做一综述。

1 凝血酶敏感蛋白促进中枢神经系统突触形成和重塑

TSP是一组由星形胶质细胞分泌的具有功能的细胞外基质蛋白，目前发现TSP蛋白主要分为5种亚型，分别为TSP1、TSP2、TSP3、TSP4和TSP5，在中枢神经系统和周围神经系统均有分布，主要调节细胞间和细胞与细胞基质间的相互作用，这些作用包括细胞黏附、细胞迁移、血管形成、炎症、突触形成、细胞增殖和凋亡等。而其他细胞外基质蛋白，如层黏连蛋白、胶原蛋白主要起支持细胞、维持组织、器官形态结构的作用[3]。在神经系统中，星形胶质细胞分泌的TSP家族蛋白能促进神经系统形成新的突触[4-5]。在新生的哺乳动物(如小鼠)中，TSP促进神经系统发育主要在出生后第2周，同时也促进其他组织的发育和成熟，包括骨、心脏和肌肉[6-7]。突触发生是一个复杂的生理、病理过程，多种细胞、细胞外基质蛋白、信号通路参与其中。离体的视网膜神经节细胞分别培养于普通培养基、星形细胞培养基，以及不与视网膜神经节细胞直接接触的星形细胞滋养层培养基中，发现后两种培养基中突触数量较前一种培养基明显增加，进一步的实验发现，星形胶质细胞来源的TSP1和TSP2能促进新的突触形成，当星形胶质细胞培养基中敲除TSP2，突触小点的数量减少了7倍，表明星形胶质细胞及其分泌的细胞外基质蛋白参与调控离体培养的视网膜神经节细胞的突触发生，TSP1和TSP2能模拟星形胶质细胞的突触发生效应[4]。在正常神经系统生理发育过程中，TSP水平在新生的幼年小鼠中枢神经系统中开始升高，但到了成年期，TSP水平又降至低水平，当某些病理因素，如外伤、肿瘤、感染等作用于中枢神经系统时，TSP水平又会上升[8-9]。小鼠中枢神经系统发育过程中若缺乏TSP1和TSP2，成年后突触数量较正常发育的小鼠降低31%[4]。TSP诱导形成的突触结构虽然在电镜下观察是正常的，但电生理实验结果显示，仅仅突触前膜有电活动，突触后膜表现出“沉默状态”，是因为突触后膜缺乏功能性AMPA受体，表明TSP不能单独诱导形成具有完整生理功能的突触[4]。TSP促进谷氨酸能兴奋性突触数量增多，但对GABA能抑制性突触的形成无明显作用，当把神经细胞与星形胶质细胞共培养时，无论培养基中有无TSP，兴奋性、抑制性突触数量均增多[10]。TSP对兴奋性、抑制性突触的不同作用导致的兴奋性、抑制性突触失衡，进而导致局部神经环路兴奋抑制失衡[11]，可能是癫痫发生的重要原因。

2 凝血酶敏感蛋白通过其受体α2δ调控神经元突触发生作用

主要位于突触前膜的电压门控钙离子通道(voltage-gated calcium channels)由四部分组成，组成其孔道结构的是α1亚基，决定钙通道的主要生理和药理功能，钙离子可通过该结构内流。α2δ、β和γ是钙通道的辅助结构，均与α1亚单位直接相连[12]，调节α1亚单位的生理功能[13-14]。α2δ具有4种构象：α2δ-1、α2δ-2、α2δ-3、α2δ-4，分别由4种单基因编码，即CACNA2D1-4[15]。α2δ分布于不同的组织中，发挥着不同的生理功能[12，16-18]，α2δ-1、α2δ-2、α2δ-3主要分布于脑组织、心脏和骨骼肌，α2δ-4分布于心脏、骨骼肌和小肠等组织[12]。α2δ-1能加强α1亚基的钙离子内流功能和增加突触末端配体结合部位[19]，α2δ-2仅能改变电流幅度，而不能改变钙通道的生理特性[16]。α2δ-3和α2δ-4与其他亚单位共表达也会对钙离子通道的电流幅度、频率、通道的失活和激活转变产生影响。尽管α2δ是电压门控钙离子通道的组成结构，但研究发现，α2δ还具有部分与钙离子通道功能无关的其他生理功能，如肿瘤生长和易感性[16，20]、骨骼肌发育、肌管迁移和发育[21]等。α2δ受体缺失不仅影响正常的生理功能，也与部分疾病的发生相关，如α2δ-1的缺失虽然不影响钙离子通道的表达水平，不阻断肌管兴奋-收缩偶联，但明显减少对延迟去极化的反应[22]。近期研究发现，α2δ-1和α2δ-3还与突触生成、神经环路重塑和突触的可塑性相关[23-24]。α2δ受体参与突触生成作用的机制主要是TSP结构中表皮生长因子(EGF)样重复序列可特异性识别α2δ受体VWF-A结构域并与之结合[23]，形成“突触生成复合体”(synaptogenic signaling complex)，发挥突触发生信号通路开关的作用[25]。TSP与α2δ受体结合激活突触再生，这一过程由多种细胞、细胞外蛋白和信号通路参与[26-27]。同时，神经元与星形胶质细胞之间进行着复杂的信息交换，星形胶质细胞主要对神经元轴突发芽、延伸、成熟与稳定等生理活动发挥调控作用[28]。相邻的神经元之间分别形成轴丝状、树状伪足，并进一步特异化形成突触前膜和突触后膜，形成结构突触雏形[28]。LIAUW等[29]利用小鼠局灶缺血模型研究缺血后突触发芽情况，发现TSP1和TSP2被敲除的转基因小鼠较野生型小鼠轴突发芽密度降低。星形胶质细胞分别与前后突触结构共同形成所谓“三突触结构”(tripartite synapses)，星形胶质细胞及其调节蛋白进一步包装修饰突触，使突触结构稳定，具备完整的突触功能[28]。该突触结构突触前膜能摄取和释放谷氨酸，但突触后膜由于缺乏AMPA受体，不具备完整的传导兴奋作用。FARIA等[30]通过膜片钳试验记录过表达α2δ-1的转基因小鼠发现，小鼠皮层电活动兴奋性增高，并有癫痫样放电活动。视频脑电图记录也显示有异常频繁的自发癫痫样放电。通过免疫荧光双标法标记兴奋性突触蛋白位点Vglut-2和PSD95，发现两者的共定位密度较对照组正常小鼠增加。类似的，在皮层外伤模型中，α2δ-1的表达上调，可能在癫痫形成中发挥重要作用。与之对应的是在α2δ-1过表达的成年转基因小鼠中，利用VGlut2和PSD-95分别标记突触前膜和突触后膜，并对共标记的突触小点计数以反映兴奋性突触的数量，结果显示，与对照组野生型小鼠相比，VGlut2与PSD-95共标记的阳性突触小点数目增加约1.8倍，兴奋性突触后电位频率增加1.63倍，且VGlut2阳性突触数量的增加并不是丘脑和皮质神经元数量上调所致[23]。表明α2δ-1的过表达上调了兴奋性突触数量、增强了突触传递功能。

3 TSP拮抗剂加巴喷丁和普瑞巴林与α2δ受体结合可抑制癫痫症状

加巴喷丁(gabapentin)和普瑞巴林(pregabalin)被广泛用于治疗各种神经系统疾病，如部分发作性癫痫[31]、神经病理性疼痛[32]、广泛焦虑障碍[33]和纤维肌痛[34]。加巴喷丁为GABA能递质类似物，但不作用于GABA受体，普瑞巴林的结构与加巴喷丁结构类似。加巴喷丁和普瑞巴林均与神经元突触α2δ受体具有很强亲和力[35]。其抗癫痫效应的分子机制有赖于与α2δ受体结合[1，35]。但加巴喷丁并不是与所有α2δ受体亚型具有很强的亲和力，其主要与受体α2δ-1和α2δ-2结合，且与α2δ-1结合的亲和力远大于α2δ-2[36]。基于加巴喷丁控制癫痫患者中枢神经系统异常放电效应，目前这两种药物已广泛用于临床以改善癫痫患者症状，最近的研究显示，加巴贲丁可能具有抑制癫痫发生的作用。主要证据如下：(1)加巴喷丁与α2δ受体结合后可阻断TSP与α2δ受体结合，从而阻断各种病理因素条件下TSP诱导的兴奋性突触生成效应[23]；(2)同时加巴喷丁和普瑞巴林与α2δ受体结合后减少突触前膜钙内流，降低突触间隙兴奋性递质的释放，达到抑制癫痫样放电的目的[37-38]，表明加巴喷丁和普瑞巴林可通过影响神经系统结构和功能抑制癫痫的发生；(3)进一步的研究发现，加巴喷丁还可协同作用于星形胶质细胞、小胶质细胞，减弱反应性胶质细胞增生从而干扰癫痫持续状态患者中枢反应性突触生成[39]，从而降低中枢神经系统癫痫样放电，改善癫痫症状[38]。在动物大脑外伤模型中，异常的兴奋性突触重组发生在外伤后3 d～2周，在外伤后急性短期应用加巴喷丁3 d可预防异常突触环路形成以及癫痫活动[40]。在新生小鼠冰冻癫痫模型中，小鼠出现癫痫症状前，大脑组织中已有异常突触形成，早期应用加巴喷丁能明显减少癫痫样兴奋性突触后电位发放频率和兴奋性递质谷氨酸的释放量[1]。

4 展望

TSP诱导突触发生为在分子水平研究癫痫发病机制提供了新方向，但癫痫的发生是一个复杂的过程，TSP诱导突触发生从组织学和电生理功能学方面部分解释了癫痫的发生机制。目前，对于癫痫的治疗主要依靠药物、生酮饮食、手术、神经调控等手段，加巴喷丁和普瑞巴林在临床上已被用于控制癫痫症状发作，加巴贲丁和普瑞巴林可能具有调控癫痫发生的潜在作用，但要完全地阐明癫痫的发生机制还有待进一步研究。