安神脐贴对实验性失眠模型大鼠自主活动及血清GABA、NE含量的影响*

甘 雨 马 进 乔 敏 张 宏 包玉龙 武晓琳 刘小虎 焦富英

(辽宁省中医药研究院， 沈阳 110034)

随着生活节奏的加快，人们所面临的各种压力骤增，失眠症已逐渐成为严重危害公众健康的问题。失眠患者由于睡眠时间不足、质量不佳，致使机体得不到充分休息，而影响日常生活，表现为精神不振、注意力不集中、行动反应迟缓、学习记忆功能下降，警觉性水平和判断力降低[1]。以往临床多采用镇静催眠类药物和心理疗法治疗，前者短期疗效尚可，但需长期服药，而长期用药会出现耐药性、共济失调、依赖性等副反应[2]；后者效果不稳定，影响因素颇多。因此，探寻一种更有效、安全的治疗方法迫在眉睫。安神脐贴为我院神经内科经验处方，由朱砂、黄连、酸枣仁等中药组成，疗效确切，且为外用制剂，安全无副作用。本研究考察了其对实验性失眠模型大鼠自主活动的影响，并初步探讨了其神经调节机制，以期为临床应用提供理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SD大鼠，SPF级，雄性，体质量180～220 g，由辽宁长生生物技术有限公司提供，许可证号：SCXK(辽)2015-0001。饲养于辽宁中医药大学附属第二医院实验动物中心，许可证号：SYXK(辽)2012-0003，温度20～23 ℃，相对湿度50%～60%，12 h光照/12 h黑暗环境。

1.2 药物与试剂

安神脐贴由辽宁中医药大学附属第二医院制剂中心提供；地西泮片由上海上药信谊药厂有限公司生产，批号：14160101。水合氯醛由国药集团化学试剂有限公司生产，批号：20150508；对氯苯丙氨酸(4-Chloro-DL-phenylalanine, PCPA)由SIGMA公司生产，批号：SHBD9164 V；生理盐水，华仁药业股份有限公司生产，批号：Q1611028。大鼠γ-氨基丁酸(GABA)检测试剂盒，购自沈阳天瑞诚生物科技有限公司，批号：201703；去甲肾上腺素(NE)检测试剂盒，购自沈阳天瑞诚生物科技有限公司，批号：201703。

1.3 仪器设备

EthoVision大小鼠行为学系统，荷兰NOLUDS公司；SPECTRA MAX 190型酶标仪，美国Molecular Devices公司；JKDP-2型电热恒温培养箱，厦门医疗电子仪器厂。

1.4 方法

1.4.1分组与模型制备: 取40只健康SD大鼠，置于12 h光照/12 h黑暗环境中适应性饲养7 d后，按体质量随机分为4 组，分别为空白对照组、模型对照组、安神脐贴(2.70 g/kg)组和地西泮(0.90×10-3g/kg)组，每组10只。除空白对照组外其余各组大鼠均腹腔注射PCPA混悬液(350 mg/kg)，空白对照组大鼠腹腔注射等体积生理盐水，每日上午9：00注射1次，连续注射2 d。造模大鼠昼伏夜出规律消失，白天睡眠时间明显少于空白对照组，表明模型制备成功。

1.4.2给药: 给予贴剂大鼠于给药前24 h腹部脱毛(6%硫化钠)，充分暴露神阙穴。安神脐贴组在腹部神阙穴部位贴敷安神脐贴2.70 g/kg，空白对照组和模型对照组在腹部神阙穴部位贴敷空白贴，均用胶布固定6 h以上，1次/d，连续5 d。地西泮组灌胃给予地西泮0.90×10-3g/kg，1次/d，连续5 d。

1.4.3一般状况观察： 每日观察大鼠一般状况及活动情况，并于末次给药前称量大鼠体质量，比较大鼠体质量增长情况。

1.4.4自主活动检测： 于末次给药60 min后，采用EthoVision大小鼠行为学系统记录大鼠自主活动情况，该系统由自主活动测试箱和图像采集分析系统两部分构成。自主活动测试箱底为1.0 m×1.0 m 正方形不锈钢箱，箱底内中央0.5 m×0.5 m正方形区域划分中央区，其余为周边区，记录10 min内大鼠移动距离、速度、出现在中央区的频率及在中央区累计停留时间。

1.4.5血清GABA、NE含量检测： 自主活动试验后，将大鼠用水合氯醛(300 mg/kg)麻醉，腹主动脉取血，3000 r/min离心10 min，取血清。按各试剂盒操作步骤处理后，用酶标仪在450 nm波长下依序测量各孔的吸光度(A)，采用外标法绘制标准曲线，计算血清GABA、NE含量。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 一般状况

造模结束后，模型组大鼠昼伏夜出规律消失，皮毛蓬乱无泽，易激怒，攻击性增强，白天也不停走动，体质量增长缓慢，与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。给药后逐渐好转，白天活动减少，睡眠时间延长，体质量明显高于模型对照组(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠体质量变化情况Table 1 The body weight changes of rats in

注：与空白对照组比较,*P<0.05；与模型对照组比较,▲P<0.05

Note： compared with the blank control group＊P<0.05; compared with the model control group▲P<0.05

2.2 自主活动情况

失眠模型组大鼠在移动距离、速度、中央区出现频率和中央区停留时间上均高于空白对照组，其中在移动距离和速度上与空白对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。表明失眠模型复制成功。经安神脐贴和地西泮治疗后，移动距离和速度较模型组显著降低(P<0.05或P<0.01)，在中央区出现频率和在中央区停留时间也有所下降。见表2和图1。

2.3 血清中GABA、NE含量测定

与空白对照组比较，模型对照组大鼠血清中GABA含量明显降低(P<0.01)，NE含量明显升高(P<0.01)。经安神脐贴和地西泮治疗后，大鼠血清中GABA含量显著升高(P<0.01)，NE含量显著下降(P<0.01)。见表3。

表2 安神脐贴对PCPA致失眠大鼠自主活动的影响Table 2 Effect of Anshen umbilical paste on autonomic activity in insomnia rats induced by

注：与空白对照组比较＊P<0.05；与模型对照组比较▲P<0.05，▲▲P<0.01

Note： compared with the blank control group＊P<0.05; compared with the model control group▲P<0.05,▲▲P<0.01

图1 各组大鼠自主活动轨迹图注：A：空白对照组；B：模型对照组；C：安神脐贴组；D：地西泮组Fig.1 The autonomous activity track map of rats in each groupNote：A: blank control group； B: model control group； C: Anshen umbilical paste group； D: Diazepam group

组 别剂量/(g/kg)GABA/(μmol/L)NE/(ng/L)空白对照组—5.30±0.22107.87±5.41模型对照组—4.36±0.37∗∗121.37±3.81∗∗安神脐贴组2.705.27±0.39▲▲105.50±3.37▲▲地西泮组 0.90×10-35.52±0.32▲▲94.59±3.00▲▲

注：与空白对照组比较**P<0.01；与模型对照组比较▲▲P<0.01

Note： compared with the blank control group**P<0.01; compared with the model control group▲▲P<0.01

3 讨论

失眠属中医“不寐”范畴，其病因病机可归纳为阴阳失交，阳不入阴，昼夜阴阳运转失常，其病位在心，与肝、肾功能密切相关[3]。治疗当以调节阴阳失衡，疏通经脉，恢复“阴平阳秘”为主[4]。安神脐贴是一种贴敷于脐部(神阙穴)的外用制剂，由朱砂、黄连、酸枣仁等组成，黄连能清心泻火，酸枣仁可宁心安神，朱砂功专镇惊安神，诸药合用可奏清心泻火、宁心安神、镇惊安神之功。贴敷于神阙穴，即可通过透皮吸收发挥药效，又可通过刺激神阙穴发挥穴效，双效叠加用以调和气血阴阳平衡，疏通经脉，从而达到“阴平阳秘”的目的[5]。现代医学研究也表明，脐部表皮角质层薄，皮下静脉网丰富，有利于药物透过皮肤吸收，又可避免肝脏的代谢分解和消化道的降解破坏，从而更好地发挥药效[6-7]。同时对神阙穴的刺激可调节人体的神经、体液平衡和免疫功能，促进人体恢复正常的生理功能。

本研究中安神脐贴可改善失眠模型大鼠的一般状况，使其白天活动减少，睡眠时间延长，体质量明显增加，与模型对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。在自主活动方面，失眠模型组大鼠在移动距离、速度、中央区出现频率和中央区停留时间上均高于空白对照组，其中在移动距离和速度上与空白对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。经安神脐贴治疗后，移动距离和速度较模型组显著降低(P<0.05或P<0.01)，在中央区出现频率和在中央区停留时间也有所下降。表明安神脐贴能够改善失眠模型大鼠的一般状况和焦虑样行为，有促眠作用。

大量临床和实验研究表明，失眠是一种由众多神经递质参与的神经调节过程[8]。GABA是重要的抑制性神经递质，能抑制神经元活动和神经传导，有助于睡眠[9]。本研究中模型组失眠大鼠血清中GABA含量明显降低(P<0.01)，促眠作用减弱，大鼠出现失眠，白天也活动不停。经安神脐贴治疗后，大鼠血清中GABA含量显著升高(P<0.01)，说明安神脐贴能增加GABA的分泌，抑制觉醒和兴奋，促进睡眠。NE是一种公认的参与觉醒的单胺类神经递质[10]，其释放量增加会引起交感神经系统活性增强，导致睡眠—觉醒紊乱，反之NE释放量减少，产生正常睡眠[11]。本研究中模型组大鼠血清中NE含量明显升高(P<0.01)，导致大鼠睡眠紊乱，经安神脐贴治疗后，大鼠血清中NE含量显著下降(P<0.01)，正常睡眠恢复。可见，神经递质GABA和NE与睡眠—觉醒周期关系紧密，而安神脐贴改善睡眠作用的机制可能与增加GABA分泌，减少NE释放，从而抑制神经元活动和神经传导，减弱交感神经系统活性，维持睡眠—觉醒周期恒定有关。