MHC单倍体型无特定病原体鸭的培育*

王兴童 孟 兴 佟相慧 陈洪岩 韩凌霞

(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物与比较医学团队，兽医生物技术国家重点实验室，黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室，哈尔滨 150069)

近交系实验动物因其遗传物质高度纯合，生物学特性和免疫学水平稳定，试验结果稳定，是开展生命科学和比较医学研究的良好实验材料，但是目前真正能满足市场化供应的近交系实验动物只有小鼠和大鼠，实验动物资源匮乏，极大阻碍了生命科学研究进展。主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC)是广泛存在于脊椎动物染色质中的一个紧密连锁、编码多个免疫相关蛋白的基因簇。其核心基因的高度多态性与自身免疫病和有遗传性相关的肿瘤免疫研究密切相关，是免疫遗传学研究的重要靶基因簇。单倍体型(haplotype)实验动物的遗传特征介于近交系和封闭群之间，特定基因组片段纯合的单倍体型实验动物，是现阶段实验动物培育的重要方向。

无特定病原体(Specific pathogen free, SPF)鸭是重要的高等级禽类实验动物，在禽病学、比较免疫学和水禽病的防控研究中发挥重要作用。中国和欧美都已培育成功并广泛使用多个单倍体型SPF鸡，但尚无单倍体型SPF鸭的报道。国家禽类实验动物种子中心以地方品种绍兴麻鸭 (Anasplatyrhynchosdomestica) 白壳I号为基础经过屏障环境下的正压隔离器饲养、物流人流阻断污染途径、饮用酸化水、饲喂60Co辐射无菌饲料等生物学净化，以闭锁群方式繁殖，实现了实验动物化，命名为HBK-SPF鸭。经过6个世代的封闭繁育后，偏离Hardy-Weinberg平衡的位点减少，以等位基因数目为标志的群体遗传多样性下降，近交程度呈上升趋势，但群体的杂合度相对稳定。经过分子遗传学分析[1]、组织学分析[2]、疫病敏感性试验[3]、细胞遗传学分析[4]、解剖学数据测定[5]和生理生化数据[6]等多项生物学特性测定，已成为成熟、稳定的SPF鸭群，在禽流感疫苗的研制中发挥了无法替代的作用[7-13]。

鸭Tap1和Tap2两个拷贝基因转录方向相反，Tap2毗邻鸭MHC I类分子重链编码基因UAA[14]。前期研究中，利用位于Tap基因的短串联重复序列(Short tandem repeat, STR)多态性，在HBK-SPF鸭群检测到4种纯合基因型，以此建立了4个MHC单倍体型，分别称为B1、B2、B3和B4[15]。为了检测4个品系的遗传稳定性，在连续4个世代分别开展了短串联重复序列(STR)、基于Tap2 基因的肽结合区序列以及基于Tap2 全基因组序列的分子遗传学分析，为MHC单倍型鸭群的遗传质量监测提供技术依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

国家禽类实验动物种子中心培育并保存的无特定病原体MHC单倍型 B1、B2、B3和B4 鸭(生产许可证编号为SCXK(黑)2011-007，使用许可证编号为SYXK(黑) 2011-022)。从出雏到淘汰，终生生活在正压鸭专用隔离器，每日限饲60Co辐照灭菌饲料，饮水为酸化水，自由饮用。

1.2 样品的制备及引物设计

无菌配制5% 柠檬酸钠溶液，翅静脉采集被检鸭抗凝血。利用Omega Blood DNA Kit提取鸭外周血基因组总DNA，或者利用AxyPrepTMMultisource Total RNA Miniprep Kit提取鸭外周血总 RNA，Prime ScriptTMII1st Strand cDNA Synthesis Kit反转录成cDNA。按照产品说明书，利用Nano Drop ND-1000浓度测定仪测定样本质量，浓度及纯度符合A260/A280=1.8～2.0的，-20 ℃备存。检测所用的引物信息见表1，由哈尔滨博仕生物技术有限公司合成。

表1 PCR引物序列及产物信息Table 1 Information of primers and amplicon

1.3 F1代鸭Tap1基因组的短重复序列分型检测

以F1代鸭的血液基因组DNA为模板，按照筛选F0代种鸭的方法，根据鸭Tap1基因组序列(登录号为AY885227)中的短重复序列位点A(在MHC I区域的位置见图1)进行分型。图1中 UXA为MHC I类分子重链的编码基因。B1、B2、B3和B4鸭各12羽、5羽、5羽和4羽。PCR反应体系为10× Taq buffer 2.0 μL，dNTP(2.5 mmol/μL)1. 0 μL, 引物AF1和AR1 (10 μmol/L) 各0.3 μL, 模板DNA (50 ng/μL)1.0 μL，Taq polymerase(2.5 U/μL)0.3 μL，加去离子水至20 μL。反应条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，59.4 ℃ 30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环；最后再72 ℃延伸7 min。扩增产物在1%的琼脂糖凝胶中电泳，分子量大小正确的送哈尔滨博仕生物公司测序。利用MEGA 6.0对序列结果与NCBI公布的AY885227和F0代鸭同时比较。

图1 位点A与鸭MHC I分子重链编码基因的相对位置示意图[15]注：A表示短重复序列，箭头表示转录方向Fig.1 The diagram of short tandem repeat sequence A with genes coding MHC I molecule heavy strainNote：A indicates a short repeat, and the arrow indicates the direction of transcription

1.4 F2代鸭TAP2 编码区的同源性分析

以F2代B1、B2、B3鸭3羽、10羽和4羽的血液基因组RNA为模板，设计并合成鸭 TAP2蛋白编码区特异性引物DuTAP2-F和DuTAP2-R，进行RT-PCR反应。按常规方法反转录。PCR反应程序为：95 ℃预变性 5 min；94 ℃ 变性 45 s，68 ℃退火2.5 min，循环 35 次；72 ℃延伸 10 min。针对Tap2基因组高变区设计并合成引物TAP-4(F)和TAP-4(R)，对F2代B4鸭18羽进行PCR扩增。取3 μL PCR 产物经1% 琼脂糖凝胶电泳，分子量大小正确的送哈尔滨博仕生物公司测序。

1.5 F3代鸭Tap2基因组序列的基因型分析

以F3代B2和B4鸭14羽和13羽的血液基因组DNA为模板，针对TAP2基因组序列的1nt-663 nt，设计鉴别引物D-TAP2-dF和D-TAP2-dR，见表1。PCR反应条件为：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火 30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃延伸10 min。取3 μL PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳，分子量大小正确的送哈尔滨博仕生物公司测序。

2 结果

2.1 F1代单倍型鸭的检测

根据序列比对结果，B1、B2、B3和B4鸭都存在短重复序列A位点，核心重复结构为GT，分别为(GT)14、(GT)11、(GT)9和(GT)17，各品系内在重复结构上游的108 nt区域(蓝色下划线)完全一致，且与F0代种鸭(图中以B1 TAP1 gene表示，B2、B3和B4略同)分别完全同源；在下游的127 nt区域(绿色下划线)，除B2内部及与F0代完全同源外，F1代的B1、B3和B4 分别出现12、6和10个碱基变异，每个位点都有2种等位基因。结果见图2，数字表示F1代鸭的个体编号。

2.2 F2代单倍型鸭的检测

根据Tap2完整编码区和1～640 nt的高变区序列比对结果，表明F2代 3个B1系鸭(图3中编号为4 113、4 124、41 34)品系内部完全一致，与F0代完全同源；10个B2系鸭(4 106、4 107、4 109、4 112、4 118、4 136、4 137、4 138、4 140和4 937)只在625位出现A和G 两种等位基因(图3中蓝色框图部分)。1～960nt区域的序列比对结果见图3。

4个B3系鸭(编号为220、222、223、224)在1～640 nt的Tap2高变区呈高度多样性，有24个位点存在2个等位基因，而B1、B2和B4均为单态。B3系鸭突变位点的基因型见表2。4个品系之间表现出明显的型特异性。

2.3 F3代单倍型鸭的遗传学分析

对F3代B2和B4鸭的Tap2 基因组1～663 nt的核苷酸序列与F0代进行比对，结果100%同源。

表2 F2代鸭TAP2 CDS区1～960 nt的突变位点及其等位基因Table 2 Mutation and alleles of Tap2 CDS 1-960 nt region of F2 haplotype ducks

3 讨论

MHC区域是有颌生物基因组具有高度多样性的区域，其基因紧密连锁，是MHC单倍型建立的理论基础。SPF鸭最初利用具有多态性的短重复序列作为MHC单倍型的分子标记，具体是根据上游108 nt、(GT)结构的重复数量以及下游127 nt的单核苷酸多态性，筛选出4种单倍型的F0代种鸭。为了检测此单倍型鸭的遗传稳定性，在后续连续3个世代，分别针对多样性更高的Tap2 基因或基因组序列进行了遗传学分析。

比对结果表明，虽然F1代B系鸭的短重复区序列及其上游侧翼序列与F0代完全同源，但在下游的127 bp内，各品系都存在多个变异，且都有2个等位基因，表明根据A位点确定的纯合个体在与其毗邻的Tap2基因内还具有多态性。SPF鸭育种部门根据本检测结果，将全部被测序列都同源的个体进行选育，剔除了下游存在多态性的个体。

在利用Tap2基因组序列对F2代的遗传学检测中，B1和B2系鸭已实现完全纯合，但B3鸭出现24个变异点，且皆为2个等位基因。因此推测B3系鸭可能存在2种等位基因型。我们根据序列比对结果，将B3鸭分为B3-1和B3-2个亚群，分别保存、选育。

再次同时为了验证B2和B4系鸭的纯合型，在对F3代遗传学检测时，另外设计引物针对高变区进行比对，结果表明未再出现变异，说明B2和B4已实现稳定性纯合。

众所周知，动物的MHC的单倍型，包括Tap基因的等位基因型，与动物的多种疫病敏感性密切相关[16-18]。同样，鸭的MHC单倍型也影响着不同品系鸭对禽流感[19]和鸭瘟[20]的致病性。本研究所选育的单倍型鸭，对F1代鸭人工感染鸭I型肝炎病毒，结果B2系鸭的死亡率(36%)明显低于其他3个单倍型(73%～93%)[21]。利用表达 H5N1亚型禽流感病毒HA基因重组鸭瘟活载体疫苗免疫F2 代HBK-SPF雏鸭，9周的观察中， B3系SPF 鸭的血凝抑制(HI)抗体效价始终显著高于其它3个品系[22]。这些结果都暗示了鸭MHC可能影响了病原微生物对鸭病的致病性。

本研究为培育水禽疾病防控专用实验动物提供了依据。