铜绿假单胞菌注射液对H22小鼠移植瘤的辅助治疗效果*

饶子亮 郑佳琳 黄 威 王 弋 潘诗云 黄绮玲 邝少松

(1. 广东省医学实验动物中心，佛山 528248)(2. 北京万特尔生物制药有限公司，北京 100000)

铜绿假单胞菌注射液(Pseudomonasaeruginosa-mannosesensitive hemagglutinin，PA-MSHA)是一种细菌类生物制剂，是以自然界中的铜绿假单胞菌为载体，通过基因工程技术表达出周身密布甘露糖敏感性血凝素菌毛的灭活疫苗(图1)。在临床上用于多种恶性肿瘤的辅助治疗，能够诱导肿瘤细胞凋亡、激活人体免疫反应，预防肿瘤的复发与转移[1-2]。铜绿假单胞菌注射液作为肿瘤辅助治疗药物，目前联合化疗的协同效果缺乏实验研究。本研究选取了H22小鼠移植瘤，验证铜绿假单胞菌注射液联合顺铂或阿霉素化疗的辅助作用，为未来相关领域的研究提供实验依据和数据参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物与饲养条件

SPF级BALB/c小鼠55只，雄性，体质量14.5～16.9 g，由广东省医学实验动物中心提供。实验动物生产许可证号：[SCXK(粤)2013-0002]，合格证号：0103987。

小鼠饲养在广东省医学实验动物中心SPF级实验动物室IVC系统内，实验动物使用许可证号：SYXK(粤)2013-0002，室内保持20～26 ℃，湿度40%～70%，采用10 h∶14 h昼夜间断照明，自由饮水、进食，水料充足，SPF级饲料产自广东省医学实验动物中心。实验方案经广东省医学实验动物中心实验动物伦理委员会审查通过。

1.2 细胞

H22细胞购自中科院上海细胞库。

1.3 主要试剂和仪器

主要仪器：倒置显微镜，日本奥林巴斯公司，型号：CKX41；超净工作台，苏州净化有限公司，型号：SW-CJ-2FD；恒温水浴锅，上海一恒科技有限公司，型号：HWS-28；低速大容量离心机，上海安亭科学仪器厂，型号：TDL-5-A。

主要试剂：铜绿假单胞菌注射液，由北京万特尔生物制药有限公司提供；RPMI1640培养基，GIBCO公司生产；新牛血清，GIBCO公司生产；青/链霉素双抗，杭州吉诺生物医药有限公司生产；胰酶，杭州吉诺生物医药有限公司生产；顺铂，南京制药厂有限公司生产；盐酸阿霉素，MBCHEM；生理盐水，广东利泰制药股份有限公司生产。

图1 铜绿假单胞菌对H22移植瘤的影响注:A组：空白对照；B组：铜绿假单胞菌组；C组：联合顺铂组；D组：联合阿霉素组；E组：顺铂组；F组：阿霉素组Fig.1 Effect of PA-MSHA on H22 transplanted tumorNote: A: blank control； B: Pseudomonas aeruginosa group；C: combined with cisplatin group；D: combined with adriamycin group；E: cisplatin group；F: adriamycin group

1.4 实验方法

1.4.1接种：复苏H22细胞，锥虫蓝染液染色计数，用 PBS配成浓度为1×l07个/mL的细胞悬液，于2只小鼠腹腔注射细胞悬液0.2 mL/只。7 d后，无菌取小鼠腹水，以PBS配成浓度为1×l07个/mL的细胞悬液，将检疫合格的53只BALB/c小鼠先剪去左侧腋下被毛，再用碘酒消毒，每只小鼠左侧腋下注射0.2 mL的H22细胞悬液，每次注射前需混匀细胞悬液。

1.4.2分组：待大部分动物的肿瘤直径长至约5 mm时，选取较均匀的48只动物，按肿瘤体积将小鼠随机分为6组：空白对照、铜绿假单胞菌组、联合顺铂组、联合阿霉素组、顺铂组、阿霉素组，8只/组。

1.4.3配制：铜绿假单胞菌注射液直接使用，无需配制，灌胃给药前恢复至室温；顺铂的配制：准确吸取1 mL的顺铂注射液，用生理盐水定容至5 mL；阿霉素的配制：准确称取2 mg阿霉素，加入10 mL生理盐水，混匀。

1.4.4给药：空白组灌胃给予PBS溶液；铜绿假单胞菌组灌胃给予PA-MSHA(1 000×108个/mL)溶液；联合顺铂组灌胃给予PA-MSHA(1 000×108个/mL)溶液，同时腹腔注射顺铂(0.2 mg/mL)；联合阿霉素组灌胃给予PA-MSHA(1 000×108个/mL)溶液，同时腹腔注射阿霉素(0.2 mg/mL)；顺铂组腹腔注射顺铂(0.2 mg/mL)；阿霉素组腹腔注射阿霉素(0.2 mg/mL)。每天灌胃给药0.2 mL/10 g，隔天腹腔注射0.1 mL/10 g，连续给药14 d。

1.4.5观察：每天观察动物1次，每周测量2次动物体质量；每周测量2次肿瘤长短径，绘制肿瘤生长曲线；肿瘤体积按公式：V=1/2ab2测量计算，a、b分别表示长和宽；相对肿瘤增殖率T/C(%)计算公式如下：T/C%=TRTV/ CRTV×100%。(TRTV：治疗组RTV；CRTV：阴性对照组RTV)。根据测量的结果计算出相对肿瘤体积(relative tumor volume，RTV)，计算公式为：RTV=Vt/ V0。其中V0为分笼给药时(即0 d)测量所得肿瘤体积，Vt为每一次测量时的肿瘤体积。

1.4.6实验结束时，完整剥离肿瘤称重，分组排列照相，计算肿瘤抑制率：肿瘤生长抑瘤率(%)=(空白对照组平均瘤质量-治疗组平均瘤质量)/空白对照组平均瘤质量×100%。

1.5 数据处理

2 结果

2.1 铜绿假单胞菌联合化疗对一般临床表现的影响

接种H22细胞后第4天，小鼠左背部皮下逐渐长出肿瘤。各组小鼠口、眼、耳、鼻均未见异常分泌物，精神状态正常，大便无稀烂，尿量未见异常，尿液澄清透明。

2.2 铜绿假单胞菌联合化疗对体质量的影响

实验结束时，与空白对照组比较，联合顺铂组、联合阿霉素组、顺铂组、阿霉素组体质量显著降低(P<0.05)，铜绿假单胞菌组体质量无显著性变化(P>0.05)，见表1。

2.3 铜绿假单胞菌联合化疗对肿瘤体积的影响

实验结束时，与空白对照组比较，联合顺铂组、联合阿霉素组、顺铂组、阿霉素组的肿瘤体积显著降低(P<0.05)，铜绿假单胞菌组的肿瘤体积无显著性变化(P>0.05)，见表2。

表1 铜绿假单胞菌对H22移植瘤小鼠体质量的影响Table 1 Effect of PA-MSHA on body weight of H22 transplanted tumor

注：*表示与空白对照组比较，P<0.05，△表示与顺铂组比较P<0.05，▼表示与阿霉素组比较P<0.05

Note：Compared with blank control group,*P<0.05；Compared with cisplatin group,△P<0.05；Compared with adriamycin group,▼P<0.05

表2 铜绿假单胞菌对H22移植瘤生长的影响Table 2 Effect of PA-MSHA on the growth of H22 transplanted

注：*表示与空白对照组比较P<0.05，△表示与顺铂组比较P<0.05，▼表示与阿霉素组比较P<0.05

Note：Compared with blank control group,*P<0.05；Compared with cisplatin group,△P<0.05；Compared with adriamycin group,▼P<0.05

2.4 铜绿假单胞菌联合化疗对肿瘤质量的影响

与空白对照组比较，联合顺铂组、联合阿霉素组、顺铂组的肿瘤质量显著降低(P<0.05)，阿霉素组的肿瘤质量无显著性变化(P>0.05)，见表2和图1。联合顺铂组、顺铂组的抑瘤率为49.2%、46.6%，联合阿霉素组、阿霉素组的抑瘤率为32.1%、19.8%，见表2。

2.5 铜绿假单胞菌联合化疗对脏器系数的影响

与空白对照组比较，联合顺铂组、联合阿霉素组、顺铂组、阿霉素组的胸腺系数和脾脏系数显著降低(P<0.05)；与顺铂组比较，铜绿假单胞菌组的胸腺系数和脾脏系数显著增加(P<0.05)；与阿霉素组比较，铜绿假单胞菌组的脾脏系数显著增加(P<0.05)，见表3。

表3 铜绿假单胞菌对H22移植瘤小鼠脏器系数的影响Table 3 Effect of PA-MSHA on organ coefficient of H22 transplanted tumor

注：*表示与空白对照组比较P<0.05，△表示与顺铂组比较P<0.05，▼表示与阿霉素组比较P<0.05

Note：Compared with blank control group,*P<0.05；Compared with cisplatin group,△P<0.05；Compared with adriamycin group,▼P<0.05

3 讨论

人类利用细菌治疗肿瘤已有一百多年的历史[3]。铜绿假单胞菌注射液是一种通过基因工程手段制备的铜绿假单胞菌生物制剂[4]，其不仅能有效激活人体的抗肿瘤免疫反应，还能直接诱导肿瘤细胞发生凋亡[5]，包括胃癌、肝癌、乳腺癌、肠癌、膀胱癌和神经胶质瘤等[6-8]。铜绿假单胞菌注射液是以自然界的绿脓杆菌为载体，通过基因工程技术表达出密布周身甘露糖敏感性(mannose sensitive hemagglutinin，MSHA)菌毛的制剂。传统观点认为，铜绿假单胞菌注射液是一种免疫增强剂，通过活化人体的细胞免疫和体液免疫反应，从而间接发挥抗肿瘤和抗感染的作用[9]。研究发现，其物质基础是铜绿假单胞菌注射液菌毛上的甘露糖结合蛋白，该蛋白能与肿瘤细胞表面的甘露糖发生特异性结合，并产生两方面的作用：① 靶向结合后改变肿瘤细胞的生物学行为，并诱导其凋亡；② 放大癌细胞的抗原信号，以刺激抗原递呈细胞，帮助重建免疫监视功能，从而阻止肿瘤细胞进一步播散和转移[8]。进一步的机理研究表明，铜绿假单胞菌注射液特有的MSHA 菌毛通过甘露糖分子的介导，阻断细胞表面EGFR 受体的活化，从而导致恶性肿瘤细胞的凋亡，该理论称为甘露糖通道途径[10-13]。

铜绿假单胞菌制剂为我国学者自主研发，国内主要用于恶性肿瘤的辅助治疗[14]。但其辅助治疗效果如何，目前需要实验数据的进一步支持。本次研究结果证实，铜绿假单胞菌注射液(1 000×108个/mL)对BALB/c小鼠一般状态、体质量、肿瘤体积和肿瘤质量无显著性影响；对H22小鼠移植瘤的直接抑制效果不明显，对顺铂化疗的辅助治疗效果不明显，对阿霉素化疗的辅助治疗有一定的增强效果；提高了脾脏系数，降低了胸腺系数。本实验探讨了铜绿假单胞菌注射液的辅助抗肿瘤活性，为未来相关领域和临床研究打下了基础。