PLGF对大鼠坐骨神经离断模型神经远端恢复的影响

王婷，于灏，胡昕 ，魏侃，王宁

（1.沈阳医学院，辽宁 沈阳 110034；2.沈阳医学院附属中心医院 手外科研究所，辽宁 沈阳 110024；3.手外1科）

外周神经损伤病程持久，甚至造成残疾，大大增加了患者的经济负担[1]，对患肢功能影响巨大，因此针对神经修复治疗方法的探寻十分重要。本实验在大鼠坐骨神经离断修复后，于断端局部添加外源性PLGF，并以人工神经鞘管包饶，创造轴突再生的营养微环境并减少PLGF向周围组织浸润[2]，通过观察不同时间点远端神经p75NGFR的表达及Bungner带的形成数量，间接反映雪旺细胞的增殖及迁移情况，从而评定PLGF在不同时间段对Wallerian变性进程的影响程度，以探索神经修复治疗的新途径。

1 材料与方法

1.1 动物模型建立

SD大鼠18只作为实验对象，体重200～300 g，由沈阳医学院实验动物中心提供。于温度适宜、食物充足、光照良好的环境中饲养。所有程序均按照动物伦理审查委员会批准的协议进行。

术前配制0.2%氯胺酮和0.2%地西泮混合溶液，按2.5 mL/100 g腹腔注射麻醉。麻醉成功后，取俯卧位于实验台上，四肢外展固定，利用眼科剪于双侧大腿及臀部后侧去毛备皮术区，碘酒常规消毒后铺孔巾。取大腿背侧纵行切口，锐性切开皮肤后，显露出股二头肌及股四头肌，钝性分离两肌肉的肌间隙，小心游离坐骨神经 15～20 mm（以便离断）（图1a），以坐骨大孔处即闭孔内肌近端1 cm平面为离断界面（图1b）。

按照 PLGF（SRP4743，Sigma，美国）说明书制备工作液，此前实验证实其最适浓度为4 nM[3]。持眼科剪取得人工神经鞘管（SSN 5/30，天义福，中国）3 mm，将其夹入之前分装好实验浓度PLGF的小管内，充分浸湿后备用。因而我们得到4nMⅠ型胶原神经鞘管-PLGF复合物。规定以大鼠左肢为实验组，右肢为对照组。对照组用8/0可吸收缝合线作神经外膜缝合神经，缝合口外包绕并固定神经鞘管（Ⅰ型胶原），而后逐层缝合皮肤。实验组用8/0可吸收缝合线缝合神经外膜后，将Ⅰ型胶原神经鞘管-PLGF复合物包绕并固定于神经缝合口，逐层缝合肌肉皮肤。本实验中实验组采用神经鞘管浸润PLGF后包绕缝合口，以期通过鞘管降解来缓释PLGF。对照组包绕鞘管为空白对照（图1c，1d）。

1.2 样本取材

分别于术后 1，4，7，15，30 d 各取出两只大鼠，以空气栓塞的方法处死，切取双侧神经缝合口远端至少2 cm长的坐骨神经，予4%多聚甲醛中浸泡固定，沿神经长轴包埋并切片。

1.3 免疫组化染色

经脱蜡水化后，经0.01 M的PBS清洗后，正常兔血清封闭30 min后倾掉，加入p75 NGFR重组抗体（EP1039Y，Abcam，美国），在 4℃环境下孵育过夜，第2天经0.01 M的PBS清洗，滴加兔IgG（SA1022，博士德，中国），室温封闭30 min后再以经0.01 M的PBS清洗。加入新鲜DAB工作液湿盒封闭，于镜下监测到合适显色后水洗，再入苏木素复染后水洗，最后入酸乙醇分化后水洗，脱水封片。

1.4 组织学评价

应用ImageProPlus6.0分析上述切片p75NGFR免疫组化阳性程度及Bungner带数量。以平均光密度值Density(mean)表达免疫组化阳性程度；以3～5个连成一线的细胞核作为Bungner带来计数。每张切片均于高倍视野下（×200）下随机取三个视野进行分析计算，数值以均数±标准差（±s）来表达，利用SPSS 19.0软件做同一时间点下实验组与对照组的成对单侧t检验，P＜0.05认为组间差异有统计学意义。

2 结果

2.1 p75NGFR免疫组化表达

p75NGFR免疫组化表达见图2。p75 NGFR在视野中表达的面积（area）和IOD分别测定值见表1。

分别计算两组每个时间点p75 NGFR的Density(mean)值。结果及趋势变化见图3，可见大鼠坐骨神经离断后对照组远端p75 NGFR的表达随时间推移而增加，4 d后其表达进入平台期，15 d后表达逐渐下降；而实验组较对照组p75 NGFR的表达在术后24 h时间点显著增加，而后其表达趋势与对照组相似，30 d时表达虽有下降，但仍显著高于对照组。

图1 手术操作示意图

2.2 Bungner带计数

在术后1 d的时间点中我们观察到Bungner带并未广泛形成，应该尚处在形成过程中。离断神经远端雪旺细胞虽未明显增殖，但实验组较对照组有多处3～5个细胞核成行排列（图2a1，a2）。统计实验组和对照组细胞核排列成行数量情况，可见实验组显著高于对照组（图4）。

3 讨论

在神经损伤后神经远端发生Wallerian变性，这个过程中雪旺细胞激活并表达p75NGFR，经历去分化、增殖，并迁移形成Bungner带是关键步骤。PLGF可以增加包括雪旺细胞在内的多种细胞的迁移能力[3-6]，而Wallerian变性时雪旺细胞表达PLGF可促进自身的增殖[7]，因此我们在离断神经缝合口添加外源性PLGF并通过与空白对照组比较，观察不同时间点神经远端p75 NGFR的免疫组化阳性的表达程度以及Bungner带形成数量，反映其对受损神经Wallerian变性进程的影响。

本实验中在大鼠坐骨神经离断后，对照组远端p75 NGFR的表达随时间推移而增加，4 d后其表达进入平台期，15 d后表达逐渐下降（图3），这与其他学者的研究结果相似，有学者认为在神经损伤后神经因子及其受体会有一个快速而短暂的的上调期，在一个月或更长时间以后回归基线水平[8]，Heng Shao等[9]则证实损伤神经远端的p75 NGFR强染色可持续14 d，而在28 d以后p75 NGFR的表达在细胞成分中明显下降。然而在本研究中通过观察实验组，我们发现p75 NGFR的表达在24 h时间点较对照组显著增加，而后其表达趋势与对照组相似，30 d时表达虽有下降，但仍显著高于对照组（图3），这说明在Wallerian变性中添加外源性PLGF具有促进p75 NGFR表达的作用，而该促进作用有可能由于外源性PLGF促进雪旺细胞增殖及促进雪旺细胞高表达p75 NGFR引起。

图2 大鼠坐骨神经p75NGFR免疫组化染色（200×镜下观）

图3 p75 NGFR不同时间点表达情况(*P＜0.05）

有学者报道神经损伤3 d后去分化的雪旺细胞大量增殖并在基膜管内形成Bungner带[10]，从而为轴突再生提供引导路径。因此本实验中我们欲计数各时间点Bungner带并进行组间对比，但在神经损伤4 d以后的各时间点雪旺细胞高度增殖无法确切计数，而在神经损伤后1 d的时间点中我们观察到离断神经远端雪旺细胞虽未明显增殖，但有多处3～5个细胞核成行排列（图2a1）且实验组细胞核排列成行的数量显著高于对照组。但此时Bungner带并未广泛形成，应该尚处在形成过程中。本实验结果显示外源性PLGF可以促进雪旺细胞成行排列，考虑到Bungner带的形成不仅单纯是雪旺细胞增殖的结果，通过细胞迁移才能成行排列从而形成Bungner带。因此我们推测外源性PLGF具有缩短Bungner带形成时间且促进Bungner带形成数量的效应。而该效应主要通过促进雪旺细胞迁移来完成。

表1 大鼠坐骨神经p75 NGFR免疫组化结果（±s）

表1 大鼠坐骨神经p75 NGFR免疫组化结果（±s）

注：实验组与对照组同一时间点p75 NGFR平均光密度值比较 *P＜0.05

时间（d） 面积(um2） IOD IOD/面积Density(mean)实验组 1 1115,048±109,573 9,466± 1,948 0.0086±0.0025*1,040,745±150,877 16,413± 6,486 0.0165±0.0086 15 1,108,992± 21,734 51,252±18,197 0.0461±0.0160 30 1,185,940± 58,788 24,428± 6,586 0.0205±0.0048*对照组 1 1,123,068±160,163 3,441± 3,207 0.0029±0.0025 4 957,977±119,385 30,867±19,142 0.0310±0.0155 7 929,473±103,460 10,801± 871 0.0116±0.0004 15 1,221,232± 3,521 30,219±20,459 0.0247±0.0167 30 1,222,087± 2,301 7,745± 5,403 0.0063±0.0044 4 764,772±172,577 17,293± 8,140 0.0217±0.0070 7

图4 1 d时间点下实验组与对照组bungner带计数比较（*P＜0.05）

本研究采用外源性PLGF应用于大鼠离断坐骨神经的缝合口，其可促进神经远端p75 NGFR高表达，可促进神经再生雪旺细胞成行排列，间接反映出外源性PLGF可促进雪旺细胞增殖及迁移，缩短Bungner带形成时间，增加Bungner带形成数量，结果证实外源性PLGF对于神经损伤修复具有积极作用，为进一步促进神经再生及修复神经缺损提供一个新的思路。