抑癌基因PRDM5在HPV16病毒致宫颈鳞癌发生过程中的作用研究

成海燕 马 晶 冯紫微 黄可金 王玉霞 张云艳

宫颈癌是危及女性生命第二常见的恶性肿瘤，在妇科恶性肿瘤中其死亡率居首位[1]。宫颈癌的主要诱发因素是人乳头瘤病毒(HPV)持续感染[2]，90%以上宫颈癌伴有高危型HPV感染，其中HPV16和HPV18感染占50%。HPV的E6和E7基因整合到宫颈上皮细胞，并持续表达是引起宫颈癌的主要因素，同时也是维持宫颈癌恶性表型的必要条件。高危型HPV亚型的癌蛋白，与宿主细胞的抑癌基因相结合，如p53和Rb，导致细胞周期失控发生癌变。PRDM5基因是新发现的一种抑癌基因，它是Krüppel样锌指基因的家族成员之一。研究表明，腺病毒介导的PRDM5表达有G2-M细胞周期阻滞和促凋亡作用[3]。PRDM5在多个肿瘤中发挥抑癌作用[4-5]。SiHa细胞是HPV16阳性细胞，抑癌基因PRDM5在宫颈癌SiHa细胞中表达下调[6]，那么我们推测HPV病毒有可能通过干扰抑癌基因PRDM5的表达导致宫颈癌发生的，为此我们进行了下列研究。

1 材料与方法

1.1 主要材料及试剂

92例宫颈鳞癌组织和30例正常宫颈组织蜡块标本均来源于2008年1月—2012年4月在哈尔滨医科大学附属肿瘤医院妇科住院手术患者，均签署患者知情同意书，临床资料完整。30例正常宫颈组织来源于同期住院因子宫肌瘤手术患者，年龄为38～55岁，中位年龄为47.6岁。宫颈癌患者年龄29～62岁，中位年龄为45岁。宫颈癌参照FIGO(2009)分期，Ⅰ期62例，Ⅱa期30例。由两位病理科医生对全部标本进行复核确定细胞分化程度及肿瘤类型。

兔抗人PRDM5多克隆抗体及HPV16 E6/18 E6(C1P5)购自美国Abcam公司；GAPDH购自北京中杉金桥公司；ABC免疫组化试剂盒及DAB购自广州中山生物试剂公司；人宫颈癌细胞系SiHa(HPV16阳性)购自中山大学；Minimum Essential Media(MEM)培养基购自GIBCO公司；HPV16 E6 shRNA质粒由Invitrogen公司合成；LipofectinTM 2000及TRIzol Reagent购自Invitrogen公司；Transcriptor First Stand cDNA System Kit逆转录试剂盒及Genopure Plasmid Midi Kit购自Roche公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫组化方法检测PRDM5蛋白及HPV16 E6/HPV18 E6蛋白的表达 应用免疫组化SABC法，于60℃烤箱中烤石蜡切片1 h，常规脱蜡至水，洗片，3%H2O2阻断10 min，以阻断内源性过氧化物酶，缓冲液洗，把片子放入高档预热3 min的柠檬酸修复液中，保温10 min，室温冷却，室温下血清封闭15 min，孵育后不洗，甩掉，擦干标本周围液体，滴加一抗工作液(稀释比例为1∶500)，4℃过夜，缓冲液洗，滴加二抗，缓冲液洗，DAB显色，自来水充分冲洗，苏木素复染，脱水，透明，封片。应用PBS液代替一抗作为阴性对照组。每张切片均在高倍镜下随机观察10个视野，每个视野内计数100个细胞。细胞核出现棕褐色或棕黄色颗粒为阳性。根据阳性细胞占百分比进行半定量处理：无核染色评分为0(阴性)，阳性细胞<10%评分为1，阳性细胞数10%～50%为2，>50%为3。最终评分2～3分者为高表达。

1.2.2 构建HPV16 E6基因的siRNA序列 根据Ambion公司提供的软件设计3对靶向HPV16 E6基因的siRNA序列，采用BLAST同源性检索确认与人类基因无明显同源性。siRNA1序列：Sense：5′-GCGACGUGAGGUAUAU-3′，Anti-sense：5′-CGCUGCACUCCAUAUACUG-3′，靶位点：HPV16 E6基因第135～153位碱基；siRNA2序列：Sense：5′-GGAACAACAUUAGAACAGC-3′，Anti-sense：5′-CCUUGUUGUAAUCUUGUCG-3′，靶位点：HPV16 E6基因第274～292位碱基；siRNA3序列：Sense：5′-GAGCUGCAAACAACUAUAC-3′，Anti-sense：5′-CUCGACGUUUGUUGAUAUG-3′，靶位点：HPV16 E6基因第73～91位碱基。同时合成FAM荧光标记阴性对照SiRNA(NC)，序列为：Sense：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′。Anti-sense：5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。以上siRNA均为21对碱基的双链结构，由Invitrogen公司合成，PAGE纯化。

1.2.3 细胞培养与转染 人宫颈癌细胞系SiHa用含10%胎牛血清的MEM培养基，置于CO2孵箱中于37℃条件下进行常规细胞培养。每3天换液一次，待贴壁细胞80%～90%融合时，用1∶1的0.25%胰蛋白酶和0.104%的EDTA混合液消化，以1∶2或1∶3的比例传代，每天倒置显微镜下观察细胞形态变化，并取第3～5代进行实验。应用Genopure Plasmid Midi Kit试剂盒，参照说明书提供的方法进行质粒DNA的提取和纯化达到转染级并定量。取对数生长期的SiHa细胞接种于6孔板中，接种密度要求24 h后细胞铺满率约为80%即可。用LipofectamineTM 2 000脂质体转染。实验分5个组：空白对照组(normal)、阴性对照SiRNA转染组(control)、SiRNA1转染组(sis-1)、SiRNA2转染组(sis-2)、SiRNA3转染组(sis-3)。以脂质体10 μL∶10 μg DNA比例进行转染，按照转染试剂盒说明书操作，于MEM中培养6 h后换完全培养基。

1.2.4 RT-PCR检测HPVl6 E6及PRDM5基因表达 HPV16 E6引物：Sense：5′-CAGTTACTGCGACGTGAGGTATATGAC-3′；Anti-sense：5′-TTCAGGACACAGTGGCTTTTGACAG-3′，扩增片段长度为234 bp。PRDM5引物：Sense：5′-GGTGCTCACAAAGTAATACACAGCG-3′；Anti-sense5′-CCTCTCACTGTTATGTATTAGCAGGTG-3′，扩增片段长度为201 bp。内参GAPDH序列如下：Sense：5′-TCCATGACAACTTTGGTATCGT-3′；Anti-sense：5′-CGTTGGCAGTGGGGACACC-3′，扩增片段长度为250 bp。上述引物均由Invitrogen公司合成，均为mRNA引物。参照TRIzol Reagent总RNA提取试剂和Transcriptor First Stand cDNA System Kit逆转录试剂盒要求的条件进行反转录。PCR反应条件：预变性95℃5 min，95℃30 s。58℃45 s，72℃30 s，45个循环，60℃1 min。取反应产物行琼脂糖凝胶电泳，观察目的条带、摄片并应用灰度分析软件分析。应用Realtime-PCR检测3个不同序列HPV16 E6 shRNA质粒转染后HPV16 E6的表达水平，经3次重复试验后，发现第3个HPV16 E6 shRNA3干扰HPV16 E6的表达比较稳定，将这一质粒留用进行后续实验。

1.2.5 Western blot检测PRDM5蛋白表达 于HPV16 E6 shRNA质粒转染后48 h收获各组细胞各约l×106个。蛋白裂解液裂解蛋白，变性，10%SDS-PAGE电泳，湿法转印PVDF膜，TBST漂洗后，5%脱脂奶粉封闭，分别与PRDM5及GAPDH一抗、二抗孵育，ECL显色，胶片曝光应用灰度分析软件分析。

1.3 统计学分析

采用SPSS 19.0统计软件分析相关数据资料，计数资料以频数和百分比表示，组间样本率比较采用χ2检验，两因素相关性利用卡方检验计算列联系数，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 宫颈癌组织与正常宫颈组织中PRDM5蛋白及HPV16/18 E6的表达

PRDM5阳性染色呈棕黄色颗粒，在宫颈癌组织中主要为核染(图1)，宫颈癌组织中PRDM5表达水平较正常宫颈组织中表达水平低(表1)，差异有统计学意义(P<0.001)。HPV16/18 E6主要为胞浆染色(图2)，在宫颈癌组织中阳性率明显高于正常宫颈组织，差异具有统计学意义(P<0.001)(表1)。

图1 免疫组化方法检测PRDM5在宫颈组织中的表达Figure 1 The expression of PRDM5 protein in cervical tissues by immunohistochemistryNote：A.The expression of PRDM5 in the nucleus(400×)；B.The strong positive expression of PRDM5 in normal cervical tissues(100×)；C.The positive expression of PRDM5 in cervical cancer tissues(100×)；D.The low positive expression of PRDM5 in cervical cancer tissues(100×)；and E.The negative expression of PRDM5 in cervical cancer tissues(100×).

GroupPRDM5n(%)χ2PHPV16/18 E6n(%)χ2PNormal cervical tissues(n=30)25(83.3)18.57<0.00013(10.0)15.06<0.0001Cervical cancer tissues(n=92)35(38.0)46(50.0)

2.2 宫颈癌组织中PRDM5蛋白表达与HPV16 E6/HPV18 E6的关系

宫颈癌组织中HPV(+)46例，HPV(-)46例，HPV(+)患者中PRDM5阳性表达率(21.7%)低于HPV(-)患者(54.3%)，HPV16 E6/HPV18 E6感染与PRDM5蛋白表达存在关联性(r=0.318，P=0.001)(表2)。

图2 免疫组化方法检测HPV16/18在宫颈组织中的表达Figure 2 The expression of HPV16/18 protein in cervical tissues by immunohistochemistryNote：A.The negative expression of HPV16/18 in cervical tissues(400×)；B.The low positive expression of HPV16/18 in cervical tissues(400×)；and C.The strong positive expression of HPV16/18 in cervical tissues(400×).

HPV16/18nPRDM5 expressionHighLowχ2PPositive461036Negative46252110.3760.001

2.3 HPV16 E6 shRNA质粒转染后对PRDM5表达影响的检测

Western blot结果显示3个不同序列HPV16 E6 shRNA质粒转染后PRDM5表达上调见图3。应用Realtime-PCR检测3个不同序列HPV16 E6 shRNA质粒转染后HPV16 E6的表达水平，经3次重复试验后，发现第3个HPV16 E6 shRNA3干扰HPV16 E6的表达比较稳定，将这一质粒留用进行后续实验。

将HPV16 E6 shRNA3三个样本转染SiHa细胞干扰HPV16 E6表达后，采用RT-PCR检测发现SiHa细胞中PRDM5表达水平，较对照组上调，2-△△CT分别为1.414214和1。

图3 Western blot检测不同shRNA转染SiHa细胞48 h后PRDM5蛋白的表达上调Figure 3 The expression PRDM5 protein in SiHa cells transfected PRDM5 shRNA for 48 h

3 讨论

PRDM(PR-domain)基因的家族成员在恶性转化和细胞分化过程中起着重要作用。另外，在实体瘤如乳腺癌、胃肠癌和肝癌等多个肿瘤中PRDM5也表达下降或缺失，启动子区甲基化是其主要原因之一。应用甲基化抑制剂5-aza-CdR，可以使肿瘤细胞中PRDM5 mRNA重获表达[3，7-9]。可见PRDM5可能是一个肿瘤抑制基因，这个基因的转录抑制在肿瘤的形成过程中发挥重要作用。PR域基因在宫颈癌中目前研究甚少。我们前期实验应用RT-PCR方法已经证实抑癌基因PRDM5在宫颈癌组织和SiHa细胞系中表达下调或缺失，表明其在宫颈癌的发生发展中发挥重要作用[6]。本次实验应用免疫组化方法再次证实宫颈癌组织中PRDM5表达水平较正常宫颈组织中表达水平低。

高危型人类乳头瘤病毒(HR-HPV)持续感染是导致宫颈癌发生的主要原因[2]。HPVl6型是最常见的高危型HPV类型之一，其早期蛋白E6及E7在宫颈鳞状上皮细胞恶性转化及恶性表型维持中均扮演着非常重要的角色[10]。人类乳头状瘤病毒与宿主细胞基因组融合并促进癌变的机制尚不清楚，整合位点往往发生在基因组不稳定的区域[11-12]。E6和E7的功能差异决定了高危型和低危型的人乳头状瘤病毒类型的致癌性差异[13]。HPV的E6和E7基因整合到宫颈上皮细胞，并持续表达是引起宫颈癌的主要因素。Marjon等[14]发现HPV16+、18+宫颈癌患者E6、E7癌基因mRNA高表达是预后不良的独立因素。Synne等[15]也发现HPV DNA阳性外阴鳞状细胞癌患者5年生存率较低。本实验中HPV16在宫颈癌组织表达的阳性率(47.9%)高于正常组织(10%)。在我们实验中将宫颈癌组织分为HPV(+)和HPV(-)两组，发现HPV(+)患者中PRDM5高表达率(21.7%)低于HPV(-)患者(54.3%)，经相关性分析HPV16 E6/HPV18 E6感染与PRDM5蛋白表达存在相关关系。我们推测PRDM5蛋白在宫颈癌组织中表达降低，部分原因是HPV16病毒导致的。我们将HPV16 E6 shRNA质粒转染宫颈癌SiHa细胞抑制HPV16表达后，应用RT-PCR及Western blot方法检测发现PRDM5表达上调，可见PRDM5表达可以被HPV16病毒感染抑制。

通过本实验研究，一方面，我们发现HPV16病毒与抑癌基因PRDM5的关系，进一步揭示宫颈癌发生发展机制；另一方面，可以使我们更好的对宫颈癌进行治疗，尤其是从基因水平进行治疗，改善治疗效果。