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兔巴氏杆菌油佐剂疫苗制备与免疫效果分析

2019-01-02刘曼李明勇刘照波张志全王召朋

中国畜禽种业 2018年12期
关键词:血清型菌液氏杆菌

刘曼 李明勇 刘照波 张志全 王召朋

(青岛康大食品有限公司 264000)

兔巴氏杆菌病是由多杀性巴氏杆菌引起的一种人畜共患病,又称兔出血性败血病,临诊特征是鼻炎、地方流行性肺炎、全身性败血症、中耳炎、结膜炎、子宫积脓、睾丸炎等不同病型。特别以季节变化、潮湿、闷热、通风不良、饲养管理不当等各种不良应激容易引起家兔发病和死亡。

2018年5月下旬以来,山东省青岛地区部分兔场在断奶前后出现大量死亡,表现为种兔张口仰脖喘气、流涎,死亡率高,剖检胸腔及心包积液,腺肿大充血,肺严重化脓性坏死,肺脏解剖面散布白色脓包,内含奶油状内容物,肝脏边缘发黑变性。

由于巴氏杆菌病血清型众多,且各血清型之间的交叉免疫保护作用较小,商品疫苗对本地流行菌株的保护效果不理想。因此,本试验利用本地区分离的巴氏杆菌3:A、6:A菌株制备自家灭活苗,观察对兔的免疫效果。

1 材料与方法

1.1 仪器及材料

1.1.1 菌种

兔多杀性巴氏杆菌3:A、6:A菌株 (青岛易邦生物工程有限公司分离鉴定,3:A对家兔的致死剂量为8~10cfu/ml,6:A菌株最小致死量为50cfu/ml)。

1.1.2 试验动物

35日龄清洁级大耳白兔30只 (青岛康大生物科技有限公司提供)。35日龄断奶商品兔2000只 (养殖户提供)。

1.1.3 主要试剂

细菌微量生化反应管、麦康凯琼脂粉、血琼脂平板、营养琼脂、改良马丁培养基等,均购于北京路桥技术股份有限公司;白油由深圳中润通化工有限公司生产;甲醛由国药集团化学试剂有限公司生产。

1.1.4 主要仪器

立式压力蒸汽灭菌购于上海博讯实业有限公司,恒温振荡培养箱购于上海博讯实业有限公司,数显隔水式不锈钢电热恒温培养箱购于上海无锡沃信仪器有限公司;医用型超净工作台购于上海三发科学仪器有限公司。

1.2 巴氏杆菌疫苗悬液的制备

将从病料中分离筛选出的菌株3:A、6:A分别接种于血液琼脂培养基上,37℃培养18h后,分别转接于马丁肉汤培养基中(1.0%血清含,0.1%血红素),37℃振荡培养18~24h,进行纯度检查合格后作为种子液。按照10%的比例将种子液再次接种于马丁肉汤中,37℃振荡培养24h,收集菌液,确保菌含量达到2.5×1010CFU/ml。

1.3 菌液的灭活

在制备好的菌液中加入甲醛溶液,使其终浓度为0.35%,37℃灭活24~48h。将这杯好的灭活菌液接种于血琼脂平板进行无菌试验,37℃培养24~48h,如血琼脂平板无细菌生长,说明菌液已完全灭活。

1.4 疫苗的制备

灭活后菌的液加入2%吐温-80完全溶解。同时按照白油92%、Span-80 6%、硬脂酸铝2%的比例均匀混合油相,高压灭菌后自然冷却至室温。将油相与灭活后的菌液按3:1的比例混合,充分混匀,乳化备用。

1.5 疫苗质量检验

1.5.1 无菌检验

取制备好的疫苗接种于血琼脂平板,检查是否有细菌生长。

鉴于干扰信号产生的原因错综复杂,且具有很大的随机性,单纯的硬件抗干扰措施很难保证信号传输、接收完全不受干扰,因此设计了必要的软件抗干扰措施。

1.5.2 粘度检验

用移液管吸取疫苗1ml,观察自然流出时间。

1.5.3 稳定性检验

采用3000r/min离心15min的离心加速分层法,观察液体分层情况。

1.5.4 疫苗的免疫效果检验

将30只清洁级试验兔随机分成3组,每组10只,第一组皮下接种疫苗0.5ml/只,第2组皮下接种1ml/只;第3组作为对照,不接种。接种14d后,每组试验兔肌肉注射致死量强毒菌液。观察各组的发病率、死亡率及剖检病死兔,观察病理变化。

1.6 疫苗的中试试验

35日龄断奶商品兔2000只,分两组,每组各1000只,试验组皮下接种1ml/只巴氏杆菌疫苗,空白对照不接种。记录70日龄出栏成活率。对死亡兔进行解剖和临床症状的记录。

2 结果与分析

2.1 疫苗质量检验分析

灭活苗接种于血琼脂平板无细菌生长,表明无菌检验合格,灭活效果良好。

附表 灭活苗效率检验结果

2.1.2 粘度检验

用移液管吸取疫苗1ml,自然流出所需时间约5s,符合油佐剂疫苗的粘度要求 (4~6s)。

2.1.3 稳定性检验

将疫苗滴于蒸馏水中,疫苗不扩散,且3000r/min离心15min后无分层,表明疫苗的稳定性良好。

2.1.4 疫苗效力检验

如附表所示为效力检验结果。对照组未接种疫苗,攻毒后全部发病,全部死亡。剖检病死兔,表现为典型的巴氏杆菌病变特征。试验组1,接种0.5ml疫苗,10只兔发病4只,死亡2只,发病率和死亡率分别为40%和20%;试验组2接种1ml疫苗,无发病和死亡,表明注射该疫苗1ml时,免疫效果最好。

2.2 疫苗的中试试验

中试试验结果:对照组未接种疫苗1000只兔,出栏存活775只,死亡225只,出栏成活率77.50%,而接种疫苗的试验组,死亡111只,出栏存活889只,出栏成活率达88.90%。分别对对照组和试验组的病死兔进行剖检和死亡原因分析。试验组死亡111只,呼吸道疾病死亡为11只,占死亡数的9.9%,腹泻发病79只,占死亡数的71%,其他死亡原因的21只,占死亡总数的18.91%。对照组死亡225只,呼吸道疾病死亡108只,占死亡总数的48%,腹泻死亡89只,占死亡总数比例39.55%,其他死亡28只,占死亡总数比例12.44%。数据表明,疫苗对兔群具有一定的保护作用。

3 讨论

本试验利用兔场分离的巴氏杆菌不同血清型的菌株,挑选致病力强的3:A和6:A血清型的菌株制备的兔巴氏杆菌油佐剂灭活疫苗,经无菌试验、安全试验检验合格后,经免疫试验证明疫苗免疫剂量为1ml时,免疫效果最好。中试试验结果表明,该疫苗起到了良好的保护作用,大大提高了商品兔的出栏成活率。对病死兔的死亡原因进行记录和剖检,试验组呼吸道疾病死亡11只,而对照组呼吸道疾病死亡108只,腹泻和其他死亡原因比例相差不大,证明该疫苗对巴氏杆菌病具有一定防治作用。

在对照组的死亡兔中分离到了3:A和6:A血清型的巴氏杆菌,而试验组中未分离到3:A和6:A血清型巴氏杆菌,仅分离到了3:F血清型巴氏杆菌,证明3:A和6:A型自家苗具有良好的免疫效果,对临床的发病具有良好的控制作用。

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