circRNA-miRNA轴在肿瘤中的研究进展△

霍佳宁，马晓欣

中国医科大学附属盛京医院妇产科，沈阳 110004

自非编码RNA（non-coding RNA，ncRNA）成为研究热点以来，其对肿瘤发生、发展的重要性逐渐被认识。继微小RNA（microRNA，miRNA）与长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）之后，环状RNA（circular RNA，circRNA）成为新的研究热点。circRNA是一类特殊的ncRNA，其最早在仙台病毒中被发现，它区别于传统的线性RNA，是一类新型的RNA，具有特殊的闭合环状结构，因此，circRNA不易降解，在多种生物体内稳定表达，更适合作为肿瘤诊断与治疗的靶点[1-2]。miRNA是在多种真核细胞和病毒中发现的一类内源性lncRNA，长度为22～28 nt，在进化方面具有保守性。miRNA在多种肿瘤中以癌基因或抑癌基因的方式发挥作用，因而与肿瘤的关系十分密切[3]。越来越多的研究表明，circRNA可以与miRNA结合影响肿瘤的生物学行为，针对circRNA-miRNA轴的研究正在被不断丰富，本文旨在综述circRNA-miRNA轴在肿瘤中的研究进展及其对肿瘤诊断与治疗的可能应用。

1 circRNA的形成及其功能

circRNA根据序列的形成和组合方式的不同分为3种类型：外显子来源的circRNA（exonic circRNA，ecircRNA）、内含子来源的circRNA（circular intronic RNA，ciRNA）、外显子-内含子 circRNA（exonic-intronic circRNA，EIciRNA）。目前发现的80%的circRNA为ecircRNA，ecircRNA的形成机制主要通过两种途径：套索驱动环化和内含子配对驱动环化。ciRNA主要通过自我剪接内含子形成。EIciRNA的形成机制目前尚未研究清楚。

目前发现的circRNA的功能主要包括以下几个方面：①作为miRNA海绵竞争性结合miRNA的结合位点，使miRNA失去其自身功能及对下游靶基因的调节功能。②调节基因转录，EIciRNA通过与基因转录起始位点上游300 bp的RNA聚合酶Ⅱ相互作用来增强基因的转录功能和调节基因的表达；同时，拼接因子MBL的第2个外显子可以环化形成circRNA，影响线性RNA的形成，以调节基因的表达。③与蛋白质相互作用，miRNA效应器Argonaute（AGO）可以通过与circRNA等结合而降解。同时，circRNA通过与蛋白质相互作用参与调节细胞的多种生理过程。④参与蛋白质翻译，大多数circRNA为ecircRNA，主要存在于细胞质中，因此，可以装载至核糖体中，并翻译成多肽。

2 miRNA的海绵作用

一些具有相同miRNA应答元件的RNA可以竞争性结合miRNA位点来影响miRNA对其靶基因的作用，从而影响肿瘤的生物学行为，称为miRNA的“海绵作用”（miRNA sponge）。目前有研究表明，circRNA也能够竞争性结合miRNA位点，影响miRNA及下游靶基因的表达。circRNA通过应答元件与miRNA相互关联后，既可以作为肿瘤抑制因子，也可以作为一种原癌基因在肿瘤的发生、发展过程中发挥重要的作用[4]。小脑变性相关蛋白1反义转录物（cerebellar degeneration-related protein 1 antisense，CDR1as）是一种miRNA的拮抗剂，作为微小 RNA-7（microRNA-7，miRNA-7）海绵影响miRNA-7靶基因的活性[5]。此外，miRNA-671可与CDR1as完全互补并引起其降解[6]。

3 circRNA-miRNA轴在肿瘤中的研究

3.1 circRNA-miRNA轴在神经胶质瘤中的研究

Zheng等[7]研究表明，环状τ-微管蛋白激酶2（tau tubulin kinase 2，TTBK2）在神经胶质瘤组织和细胞系中的表达上调，而线性TTBK2在神经胶质瘤组织和细胞系中并无差异性表达。环状TTBK2的高表达可以促进胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭，并抑制其凋亡。环状TTBK2可以作为miRNA-217海绵抑制miRNA-217的表达，从而影响下游靶基因肝细胞核因子 1β（hepatocyte nuclear factor 1 beta，HNF1β）的表达以及胶质瘤的生物学行为。

3.2 circRNA-miRNA轴在多形性胶质母细胞瘤中的研究

研究表明，在45例多形性胶质母细胞瘤患者的组织中和5例多形性胶质母细胞瘤患者的细胞系中，miRNA-671-5p呈现过表达，并且影响了多形性胶质母细胞瘤细胞的迁移，在较小程度上影响了胶质母细胞瘤细胞的增殖。此研究利用生物信息学预测确定CDR1as、CDR1、VSNL1为miRNA-671-5p的靶基因，它们在胶质母细胞瘤中的表达均下调，且与miRNA-671-5p有关，故认为miRNA-671-5p/CDR1as/CDR1/VSNL1轴可以影响多形性胶质母细胞瘤细胞的生物学行为[8]。

3.3 circRNA-miRNA轴在肝细胞癌中的研究

在肝细胞癌中，hsa_circ_0005986的表达下调，其可以作为miRNA-129-5p的海绵，使miRNA-129-5p得到释放，进而使下游靶基因Notch1的表达下调，加速肝癌细胞的增殖，促进肝癌细胞由G0/G1期向S期转变[9]。Huang等[10]利用circRNA芯片检测出226个在肝细胞癌组织中差异性表达的circRNA，其中，189个circRNA的表达上调，37个circRNA的表达下调。circRNA-100338是上调的circRNA之一，作为内源性海绵与miRNA-143-3p结合从而影响肝癌细胞的侵袭。该研究认为，circRNA-100338是对肝细胞癌的诊断和治疗具有潜在价值的标志物。Xu等[5]研究证实，ciRS-7（CDR1as）在并发微血管侵犯（microvascular invasion，MVI）的组织中的表达与miRNA-7的表达呈负相关，ciRS-7可以作为肝MVI的生物标志物和MVI治疗的靶向标志。circMTO1在肝细胞癌组织中的表达明显下调，circMTO1作为致癌基因miRNA-9的海绵来影响p21的表达。有研究认为，circ-MTO1是肝细胞癌治疗的潜在靶点，肝细胞癌组织中circMTO1表达的下降可以作为预测患者预后的指标[11]。Shang等[12]采用定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）验证肝细胞癌组织中3个circRNA的表达，结果发现，hsa_circ_0005075的表达差异最明显，且相对表达量与肝细胞癌的肿瘤大小有关，并构建了以hsa_circ_0005075为中心的circRNA-miRNA相互作用网络，包括 miRNA-23b-5p、miRNA-93-3p、miRNA-581、miRNA-23a-5p，其关系有待进一步研究证实。研究表明，与正常肝组织相比，CDR1as在肝细胞癌组织中的表达上调，miRNA-7在肝细胞癌组织中的表达下调。此外，敲除CDR1as、过表达miRNA-7可以抑制肝癌细胞的增殖和侵袭。miRNA-7过表达可以抑制其下游靶基因CCNE1和PIK3CD的表达，敲除CDR1as可以抑制miRNA-7的表达，也可以抑制CCNE1和PIK3CD基因的表达[13]。

3.4 circRNA-miRNA轴在骨肉瘤中的研究

有研究表明，circUBAP2在人骨肉瘤组织中的表达有所增加，与骨肉瘤的进展和预后密切相关，表达上调的circUBAP2可以促进骨肉瘤细胞的生长并抑制其凋亡。circUBAP2通过抑制miRNA-143的表达，影响抗凋亡基因B细胞淋巴瘤因子-2（B cell lymphoma-2，Bcl-2）的表达[14]。

3.5 circRNA-miRNA轴在胃癌中的研究

circRNA_100269在胃癌组织中的表达水平降低，双荧光素酶实验证实circRNA_100269与miRNA-630靶向结合，且miRNA-630在胃癌组织中呈现高表达，并与circRNA_100269呈负相关，过表达circRNA_100269抑制了miRNA-630的表达，同时抑制了胃癌细胞的增殖[15]。miRNA-7过表达可以抑制胃癌细胞的恶性生物学行为，并且这种抑制作用可以被作为miRNA-7海绵的ciRS-7的过表达所中和，且二者的相互作用进一步影响人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源/磷脂酰肌醇-3-羟激酶/蛋白激酶B（phosphates and tensin homologue deleted on chromosome ten/phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase/protein kinase B，PTEN/PI3K/AKT）通路[16]。

3.6 circRNA-miRNA轴在乳腺癌中的研究

Liang等[17]通过circRNA芯片筛选出乳腺癌组织中差异表达的circRNA，发现circ-ACBC10在乳腺癌组织中的表达上调，沉默circ-ACBC10可以抑制乳腺癌细胞的增殖并促进其凋亡。通过生物信息学预测与荧光素酶报告基因实验证实，circ-ACBC10与miRNA-1271靶向结合，并且circ-ACBC10作为miRNA-1271海绵影响乳腺癌细胞的生物学行为。

3.7 circRNA-miRNA轴在肺癌中的研究

有研究证实，cir-ITCH作为miRNA-7与miRNA-214的海绵通过增强其亲本基因ITCH的表达抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活，从而抑制肺癌的进展[18]。Tian等[19]在前期研究中证实，肉桂醛（cinnamaldehyde，CA）可以诱导3种非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）细胞发生凋亡，然后通过芯片及荧光定量PCR发现hsa_circ_0043256的表达在CA处理的NSCLC细胞中上调，其可以抑制NSCLC细胞的增殖并诱导其凋亡。通过生物信息学预测并应用荧光素酶实验验证，hsa_circ_0043256作为miRNA-1252海绵，可调节亲本基因ITCH的表达并影响Wnt/β-catenin信号通路。hsa_circ_0043256/miRNA-1252/ITCH轴介导的新机制为肺癌的治疗提供了新的方向。

3.8 circRNA-miRNA轴在食管鳞状细胞癌中的研究

Li等[20]利用PCR实验分析了来自中国东部和南部共684例食管鳞癌患者的食管鳞状细胞癌组织与相应癌旁组织中cir-ITCH的表达水平，发现与癌旁组织相比，cir-ITCH在食管鳞状细胞癌组织中的表达水平较低。cir-ITCH发挥海绵作用与miRNA-7、miRNA-17、miRNA-214 结合，使 ITCH的表达上调，使磷酸化Dvl2发生泛素化并降解，进而阻断Wnt/β-catenin信号通路。

3.9 circRNA-miRNA轴在结直肠癌中的研究

在结直肠癌中，circ-001569与miRNA-145的表达呈负相关，miRNA-145与E2F5的表达呈负相关，BAG4与FMNL2的表达呈负相关，通过circ-001569-miRNA-145-E2F5/BAG4/FMNL2 轴影响肿瘤细胞的增殖和侵袭[21]。Zhang等[22]采用定量PCR检测has_circ_0020397和miRNA-138在结直肠癌细胞中的表达情况，发现has_circ_0020397的表达上调，miRNA-138的表达下调，两者的表达呈负相关。在证实二者存在差异性表达且表达具有相关性后，应用双荧光素酶报告基因实验验证了二者的靶向结合与结合位点。has_circ_0020397可以增强结直肠癌细胞的活力，促进结直肠癌细胞的侵袭，并抑制其凋亡，而miRNA-138具有相反的作用。

3.10 circRNA-miRNA轴在膀胱癌中的研究

Huang等[23]利用芯片检测4例膀胱癌患者癌组织及癌旁组织中lncRNA、circRNA和信使RNA（messenger RNA，mRNA）的表达图谱，检测出数千个显著改变的lncRNA和mRNA以及数百个circRNA。5个lncRNA和4个mRNA通过实时荧光定量PCR在30例患者的癌组织与癌旁组织中得到证实，circRNA-MYLK作为miRNA-29a-3p海绵使靶基因DNMT3B、VEGFA和ITGB1的表达上调。Zhong等[24]通过circRNA芯片筛选出在膀胱癌组织中差异表达的circRNA，并采用定量PCR验证，利用生物信息学方法预测可能与之结合的miRNA，随后证实circTCF25的过表达可以下调miRNA-103a-3p和miRNA-107的表达，上调CDK6的表达，促进膀胱癌细胞在体内和体外的增殖、转移，因此，circTCF25可能成为膀胱癌新的标志物。

3.11 circRNA-miRNA轴在基底细胞癌中的研究

Sand等[25]在基底细胞癌中发现了71个差异表达的circRNA，且circRNA与miRNA有结合位点，提示circRNA-miRNA轴在基底细胞癌中也发挥作用。

3.12 circRNA-miRNA轴在妇科肿瘤中的研究

CDR1as与环形的睾丸特异性RNA分子SRY是两个经典的circRNA，它们含有miRNA-7和miRNA-138结合元件，且miRNA-7和miRNA-138在卵巢癌和宫颈癌中发挥抑制作用[26-27]。

3.13 其他

Zheng等[28]通过测序筛选出在6种正常组织（脑、结肠、心脏、肝、肺和胃）和7种肿瘤（膀胱尿路上皮细胞癌、乳腺癌、结直肠癌、肝细胞癌、胃癌、肾细胞癌和前列腺癌）组织中存在差异性表达的circRNA——circHIPK3。进而通过荧光素酶实验得出circHIPK3直接结合miRNA-124并抑制miRNA-124的活性的结论。

4 小结与展望

如今，恶性肿瘤的发病率呈逐年上升趋势，因此，寻找到早期诊断肿瘤的标志物以及有效的治疗靶点显得尤为重要。circRNA早在20世纪就已经被发现，但是都认为它是一种拼接错误，并未引起重视，近几年来，证实其广泛存在于生物体内，使人们对真核生物转录组的认识更加深刻。circRNA在生物体内的作用越来越受到人们的重视，尤其在肿瘤方面，circRNA成为继miRNA、lncRNA后新的研究热点。但是，这个领域依然存在很多问题，例如逆转录过程中的模板转换和滚环扩增、缺乏命名circRNA的统一标准等。同时可以看出，除了对CDR1as-miRNA-7和cir-ITCH-miRNA7/214这两种circRNA-miRNA轴的研究较多外，对其他circRNA-miRNA轴的研究均相对较少[29-30]。从疾病方面可以看到，circRNA-miRNA轴在肝细胞癌中的研究较多，在其他恶性肿瘤中的研究较少，在妇科肿瘤中更是少有研究。同时，对circRNA-miRNA轴的形成机制、功能及其在肿瘤中作用的研究还不够深入。研究者应该借鉴miRNA与lncRNA的研究思路，建立全面的、不断更新的circRNA数据库并形成circRNA-miRNA-mRNA网络，将几种ncRNA的研究联系在一起。更多的circRNA需要被发现，而它的保守性、稳定性及组织特异性的特点使它有望成为新的肿瘤标志物和肿瘤治疗的新靶点，为临床的诊断和治疗提供新的视角和新的方向，也为明确circRNA-miRNA轴在多种肿瘤发生、发展中的作用、机制以及为开发新的抗肿瘤药物提供了新的思路。