酉州乌羊精液不同保存方法对羔羊卵母细胞体外受精效果的影响

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(1.重庆市畜牧科学院，重庆 400015；2.重庆市山羊工程技术研究中心，重庆 荣昌 402460)

0 引言

酉州乌羊乌皮白被毛，独具特色，具有“药羊”的美称，是珍稀的国家级畜禽遗传资源，但目前资源调查显示该品种已濒临灭绝，急需采取有效的措施来增加种群数量[1]。人工授精是加速优秀种畜繁育的关键技术之一。目前笔者的研究团队已在酉州乌羊配子资源方面进行了一些研究，包括精液保存[2]，卵母细胞体外发育[3]等，本研究以酉州乌羊羔羊羔羊卵母细胞为材料，研究了3种不同精液的保存方法对羔羊卵母细胞体外受精效果的影响，为挖掘利用这一独特资源提供科学依据。

1 实验材料

1.1 卵母细胞

来自酉州乌羊幼羊体外成熟的卵母细胞。

1.2 精液

来自酉州乌羊资源保护场种公羊。

2 方法

2.1 实验分组

实验分为3组，鲜精组、低温保存组和冻精组，分别为采集的新鲜精液、低温保存的精液和采用细管法冷冻保存的精液。

2.2 精液采集及处理方法

对同一只酉州乌羊种公羊采用假阴道法获取精液，镜下检测后进行后续实验。鲜精组处理方法是根据密度用精液稀释液进行3～5倍稀释后立刻使用；低温组处理方法是精液稀释后放到冰箱冷藏室4℃保存过夜，使用时放在水浴锅中37℃升温30 s；冷冻组处理方法是从液氮中取出细管冻精立即放入38℃水浴锅内，升温15 s。

2.3 精子获能

先在离心管中39℃水浴锅中预热2 mL受精液，然后将200 μL稀释后的鲜精、低温保存精液或解冻后冻精用移液器缓慢注入管子底部，静置30 min收集上清液，然后置于39℃的CO2培养箱中待用。

2.4 体外受精

将体外培养成熟的COCs检出，置于HSOF操作液中，用移液枪进行吹打脱除部分颗粒细胞和精子，先在HSOF操作液中洗三次，HSOF操作液组成为：HSOF+3 mg/mL BSA，再在受精液中洗3次，受精液组成为：mSOF+10 μg/mL肝素+0.2 μm/L青霉胺+0.1 μm/L亚牛磺酸+10%EGS。然后移入40 μL的受精液滴中，每个液滴放入15枚左右的成熟COCs，再加入密度为1×106个/mL的获能精子，置于5%CO2、饱和湿度和38.5℃的CO2培养箱中共孵育18 h。

2.5 胚胎体外发育

将受精18 h后的卵置于HSOF操作液中，用移液枪吹打脱除精子和颗粒细胞，依次在HSOF操作液、胚胎发育液中洗涤3次，放入发育液中，其中每个40 μL的小液滴中移入受精卵15枚左右，然后置于5%CO2、饱和湿度和38.5℃的CO2培养箱体外发育，培养48 h后进行卵裂情况检查。

3 结果

检测鲜精组、冻精组和低温保存组，IVF后统计各组48 h卵裂率。实验结果表明冷冻组的卵裂率(42.64%)低于鲜精和低温保存组，但不同精液保存法的体外受精后卵裂率(42.64%、48.31%、45.13%)差异未达到显著水平(P>0.05)。(见表1)。

表1 精液不同保存方法对羔羊卵母细胞体外受精效果影响

注:同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

4 讨论

酉州乌羊长期以来生长在封闭的环境中，以放牧为主,饲养管理相对粗放，主要通过自然交配的方式进行繁殖。酉州乌羊新鲜精液的采集使用经常受到时间地点的限制，在夏季及冬季山羊乏情季节不能保证采集精液的质量，另外资源保护场与实验室相隔也较远，前期本研究团队对酉州乌羊种公羊的精液品质特性和生产水平进行了鉴定和评估[2], 后续实验制作了酉州乌羊细管冻精[4],通过冷冻等方法，积极探索酉州乌羊种质资源的利用途径。

陈晓勇[5]比较了精液保存方法对羔绵羊卵母细胞体外受精效果影响，结果表明鲜精组卵裂率显著性高于低温保存和冷冻保存精液组(P<0.05),与本研究结果有所差异。本实验研究结果表明冻精组卵裂率低于新鲜精液组和低温保存的精液组，可能是由于精液经过冷冻解冻处理后，影响了精子受精能力，但不同保存方法受精效果未达到显著水平，说明可以在实际工作中可以尝试对酉州乌羊细管冻精进行一些探索利用。