QuEChERS-超高效液相色谱-串联质谱测定饲料中8种人工合成抗氧化剂

2018-12-29，，

畜禽业 2018年12期

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(福建省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，福建福州 350003)

0 引言

近年来，我国的饲料抗氧化剂产业迅速发展，在生产巨大效益的同时存在一定的安全隐患，极大的威胁着动物及人体健康，饲料抗氧化剂的乱用、滥用已成为行业亟待解决的一大问题。在对饲料抗氧化剂的使用过程和氧化剂的残留量进行有效监察中，氧化剂筛查检测技术的创新最为值得我们关注。抗氧化剂在饲料领域中被大量的使用，但是人工合成抗氧化剂使用过量会进入食物链，对人产生毒性。国家在抗氧化剂的使用方面，有较为严苛的规定，使用的安全性越来越受到关注，而发展饲料中抗氧化剂的快速检测技术是研究者一直关注的问题样品的前处理过程对于检测方法相当的重要，直接影响到建立的方法是否能够获得良好的准确性、灵敏性和选择性。到现在为止，已存在大量关于饲料样品前处理技术和方法的研究，均在不同程度上提高了检测方法的灵敏度和选择性。针对不同类型饲料样品不同提取和净化目的，常用的有超声提取、凝胶渗透色谱、固相萃取、QuECHERS、索振荡提取等前处理法[1]。

当前，人工合成抗氧化剂的检测方法主要包括分光光度法、电化学分析法、薄层色谱法、高效液相色谱法、气相色谱法、气相色谱质谱法及高效液相色谱串联质谱法等分析方法[2]。虽然分光光度法检测成本低，操作简单，但是其灵敏度低，很大程度上不能做到痕量分析；而另外一种电化学分析法灵敏度高、检测方便迅速，所以检测微量化合物和生物活性成分时被大量运用，但是它测定的抗氧化剂种类十分稀少，成为一种主流的检测方法仍具有一定的局限性[3]；薄层色谱法的优势是在短时间内它可以处理大批规模样品，溶剂的使用量较少，损耗减少，仪器易于操作，但是这种方法操作步骤略多，而且无法同时检测不同的抗氧化剂[4]。对于饲料中多种人工合成抗氧化剂的同时定量，当前的报道并不多[5-7]。本文主要对饲料中抗氧化剂的前处理进行了探索，建立多种抗氧化剂同时检测的QuEChERS前处理法-超高效液相色谱串联质谱，对饲料中不同抗氧化剂的残留进行了分析。

1 实验部分

1.1 仪器、材料与试剂

仪器ACQUITY UPLC H-Class超高效液相色谱仪(美国Waters公司)，Xevo TQMS三重四级杆质谱(美国Waters公司);CPA225D型十万分之一分析天平(德国Sartorius公司)，KQ-500E台式超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，FY135型中草药粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)。

Vortex QL - 901涡旋仪(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)，TDZS WS台式低速离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司)，5415 D高速离心机(德国Eppendorf公司)，15 mL (聚四氟乙烯离心管，0.22 μm有机微孔滤膜。乙酸铵(LC-MS级，Waters公司)、甲酸(LC-MS级，Waters公司)、40 μm乙二胺-N丙基硅烷(PSA，天津博纳艾杰尔有限公司)、40～60 μm C18吸附剂天津艾杰尔科技有限公司)、无水硫酸镁、氯化钠、 (分析纯，天津市科密欧公司)、超纯水(Millipore超纯水机制备)、微孔滤膜(0. 22 μm，天津津腾公司)。

标准品：乙氧基喹啉(EQ)、没食子酸丙酯(PG)、去甲二氢愈创木酚(NDGA)、2,6-二叔丁基-4-甲氧基苯酚(Ionox-100)、没食子酸辛酯(OG)、没食子酸月桂酯(DG)，纯度分别为99.5%，97.5 %，99.0 %，99.5%，97.0 %，98.0 %，购于国家标准物质中心；2,6-二叔丁基-4-甲氧基苯酚(HMBP)、2,4,5-三羟基苯丁酮(THBP)，纯度分别为99.0 %，98.0 %，购于德国Dr. Ehrenstorfer GmbH公司，实验用水均为超纯水。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 液相色谱条件

色谱柱：Waters-C18柱子，色谱柱(Φ1.8 μm，2.1 mm x 50 mm)；柱温30. 0 ℃，流速0. 2 mL/min；进样量4 μL，流动相A为0.05%甲酸溶液，流动相B为乙腈，梯度梯度洗脱： 0～2 min，10%～30 %；2～4 min，维持30% B；4～7 min，30%～70%B；7 ～10 min，维持30% B；10～12 min，30%～10%B。

1.2.2 质谱条件参数

离子化模式：电喷雾电离正离子模式(ESI+)和电喷雾电离负离子模式(ESI-)，质谱扫描模式多反应监测；毛细管电压：2.5 kV；脱溶剂气流： N2，流速800 L /h，脱溶剂温度 500 ℃；锥孔气流：N2，流速50 L /h；离子源温度：150 ℃；碰撞气体：氩气，雾化气压力0. 28 MPa；碎裂电压，135 V；毛细管电压，3 500 V；MRM定量模式，8种分析物的质谱分析条件如表1所示。

表1 抗氧化剂的监测离子对、保留时间和碰撞能量

1.3 样品预处理[8-10]

提取称取2.0 g已混匀的饲料样品于50 mL离心管中，加入10 mL乙睛，用高速均质器以4 000 r/min 均质30 s在3 000 r/min离心5 min，倾出上清液于250 mL鸡心瓶中；重复提取1次，合并提取液于40 ℃以下旋转蒸发至约1 mL (高度真空，10 min之内完成)，并转移至10 mL刻度离心管中。用少量纯乙睛洗鸡心瓶，合并于离心管中，浓缩定容至2 mL，加入150 mg C18，3 000 r/min离心5 min，过0. 45 μm，过滤后供UPLC-MS/MS分析。

2 结果与分析

试验考察了不同流动相(乙腈-5 mmol /L 乙酸铵、乙腈-0.1%甲酸) 的影响。结果表明：使用乙腈-0.1%甲酸时，部分化合物的峰形比较差且存在拖尾现象；当改为乙腈-5mmol/L 乙酸铵作流动相时，8种化合物峰形尖锐、信噪比好。

利用标准品使用外标法，根据各抗氧化剂的响应情况进行上机条件的优化，然后在优化后的色谱、质谱条件下，检测出水产饲料中抗氧化剂残留情况。根据所得到的数据，以定量离子离子流图的峰面积( y) 为纵坐标作图，标准物质的浓度(μg /L) 为横坐标，得到各物质的标准曲线方程和线性回归系数。以3倍的信噪比(S/N≥3)来确定各组分检出限(LOD)，并试验不同饲料中抗氧化剂的加标回收率[11-13]。在线性范围内，得到各类被检测物质的标准曲线线性方程和检出限，如表2中所示。

表2 8种抗氧化剂的线性范围、线性方程、相关系数及检出限

根据各目标物的响应信号情况及线性范围，对8种人工合成抗氧化剂在饲料基质中进行了各自的低、中、高3个不同浓度加标水平的加标，相应的平均回收率为76.2%～102.8%，方法符合农药残留的检测要求，如表3中所示。

表3 不同抗氧化剂在饲料基质中不同水平的的加标回收率

3 实际样品检测

在优化后的色谱、质谱条件下，采集了市面上40余种不同类型的主要的猪和水产饲料(鱼饲料、虾、乌龟饲料)，利用建立的方法对其中的抗氧化剂的残留情况进行了检测。总体来说，所采样的水产饲料中的抗氧化剂的残留情况总体良好，相比其他的抗氧化剂，EQ、PG、NDGA、 HMBP在饲料中可以检测到，其含量情况为乙氧基喹啉(EQ) ，0.18～2.37 mg/kg；去甲二氢愈创木酸(NDGA)，0.03～0.06 mg/kg；2,6-二叔丁基-4-羟甲基苯酚(HMBP)，0.09～0.13 mg/kg ；没食子酸丙酯(PG)0.11～0.13 mg/kg。