血清miR-18a水平与抑郁症患者HPA轴功能亢进相关性分析

万志佳，陈石磊，刘文果△（.沙坪坝区妇幼保健计划生育服务中心检验科，重庆 400030；.陆军军医大学军事预防医学院防原医学教研室，重庆 400038）

抑郁症是严重危害人类健康的常见精神疾病，其发病的细胞和分子机制尚未完全阐明。研究发现，内分泌系统功能异常在抑郁症的发生、发展中起着非常重要的作用[1-2]。近年研究表明，下丘脑-垂体-肾上腺轴（HPA轴）功能亢进与抑郁症的发生、发展密切相关[3-4]。微小RNA（miRNA）是一类长约22 bp的内源性非编码小RNA，可调控约30%的细胞内基因，与心血管病、糖尿病、肿瘤、精神疾病等的发病机制密切相关[5-6]。miRNA可能在抑郁症患者的HPA轴功能亢进中发挥重要作用[7-8]。本研究分析了抑郁症患者血清miR-18a与HPA轴功能亢进的相关性，旨在为抑郁症诊疗提供新的思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料 于2015年4月至2017年4月确诊的抑郁症患者50例纳入抑郁症组，男27例、女23例，年龄 21～48 岁，平均（31.8±7.5）岁，病程 3～15个月，平均（8.3±5.1）个月，符合《中国精神疾病分类方案及诊断标准（第2版修订本）》情感性精神障碍抑郁发作诊断标准，其中单相31例，双相19例。同期体检健康者50例纳入对照组，男27例、女23例，年龄20～50岁，平均（32.5±8.3）岁。两组研究对象年龄、性别比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 血液样本处理 采集所有研究对象静脉血，4℃条件下2 000 r/min离心10 min，收集血清，液氮保存备用。

1.2.2 血清miR-18a测定 （1）miRNA的提取和纯化：采用mirVana PARIS Kit（美国Ambion公司）试剂盒提取和纯化miRNA。取血清样品500 μL，室温下加入等体积变性液，立即充分混匀后加入等体积酸性酚氯仿，涡旋震荡 30～60 s；室温下 14 000 r/min离心 5 min。取上清液于新管中，加入1.25倍体积的无水乙醇，充分混匀后加入到柱子中，12 000 r/min离心30 s，弃滤液；向柱子中加入 700 μL 洗液 1，12 000 r/min 离心 30 s，弃滤液；向柱子中加入500 μL洗液2/3，12 000 r/min离心30 s，弃滤液；重复用500 μL洗液2/3洗涤1次，弃滤液后12 000 r/min离心1 min；加入60 μL 95℃预热洗脱液到柱子中，12 000 r/min 离心 1 min，收集 miRNA。（2）逆转录扩增：采用TaqMan®MicroRNA Revers Transcription Kit试剂盒将提取的miRNA逆转录成cDNA，按说明书操作。miR-18a逆转录反应条件：16℃30 min，42℃ 30 min，85℃ 5 min。miR-18a逆转录引物序列：5′-CTC GTA TCC AGT GCA GGG TCC GAG GTA TTC GCA CTG GAT ACG ACG CCA A-3′，上游引物序列：5′-GAT AGC AGC ACA GAA ATA TTG GC-3′，下游引物序列：5′-GTG CAG GGT CCG AGG T-3′。U6 逆转录反应条件：37℃ 30 min，85℃ 5 min。U6逆转录引物序列：5′-GTC GTA TCC AGT GCA GGG TCC GAG GTA TTC GCA CTG GAT ACG ACA AAA ATA T-3′，上游引物序列：5′-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3′，下游引物序列：5′-GTG CAG GGT CCG AGG T-3′。（3）实时荧光定量聚合酶联反应（PCR）扩增：采用Maxima SYBRGreen qPCR Kit试剂盒（美国赛默飞公司），按试剂盒说明书操作。结果采用比较阈值法计算，即：目的基因的量=2-△△Ct，△△Ct=（实验组目的基因Ct值-实验组管家基因Ct值）-（对照组目的基因Ct值-对照组管家基因Ct值）。

1.2.3 血清指标检测 采用放射免疫法检测血清标本促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）、促肾上腺皮质激素（ACTH）、皮质酮（CORT）水平。检测试剂购自南京建成生物试剂研究所。按试剂盒说明书操作。

1.3 统计学处理 采用SPSS13.0软件进行数据处理与统计学分析。计量资料以±s表示，组间比较采用单因素方差分析，相关性分析采用Pearson分析。P＜0.05为比较差异和统计参数有统计学意义。

2 结 果

2.1 血清miR-18a表达水平检测 抑郁症组血清miR-18a表达水平较对照组显著上调（P＜0.01），见图1。

图1 抑郁症组与对照组血清miR-18a表达水平

2.2 血清CRH、ACTH、CORT水平检测 抑郁症组血清CRH、CTH、CORT表达水平较对照组显著上调（P＜0.05），见表1。

表1 抑郁症组与对照组血清CRH、ACTH、CORT水平比较（±s，n=50）

表1 抑郁症组与对照组血清CRH、ACTH、CORT水平比较（±s，n=50）

注：与对照组比较，aP＜0.05

组别抑郁症组对照组CORT（μg/L）216.53±63.25a 124.56±35.22 CRH（ng/L）9.41±2.46a 5.98±1.49 ACTH（ng/L）21.38±6.54a 13.76±4.05

2.3 抑郁症患者血清miR-18a与CRH、ACTH、CORT相关性分析 Pearson相关性分析结果显示，抑郁症患者血清miR-18a与血清CRH、ACTH、CORT水平呈显著正相关，相关系数分别为0.89、0.73、0.81，P值分别为0.006、0.024、0.013。

3 讨 论

抑郁症是由多种因素引起的情感障碍性疾病，以显著而持久的心境低落为主要临床特征，是心境障碍的主要类型，临床可见心境低落与其处境不相称，情绪的消沉可以从闷闷不乐、悲痛欲绝、自卑抑郁到悲观厌世，可有自杀企图和行为，甚至发生木僵；部分患者有明显的焦虑和运动性激越，严重者可出现幻觉、妄想等精神病症状，每次发作持续至少2周以上，长者甚至数年；多数患者有反复发作的倾向，每次发作大多数可以缓解，部分可有残留症状或转为慢性。抑郁症发病机制复杂，至今尚未完全阐明，相关学说包括炎症学说、单胺类神经递质及其受体学说、HPA轴功能失调学说、神经营养因子学说等[9]。神经内分泌系统的功能改变，特别是HPA轴功能的改变可能在抑郁症发生、发展中发挥重要作用。HPA轴是神经内分泌系统的重要部分，参与控制应激反应，并调节许多身体活动，如消化、免疫反应、心情和情绪、性行为，以及能量储存和消耗等。HPA轴功能亢进被认为是抑郁症重要的病理生理变化。本研究比较了健康者与抑郁症患者血清CRH、ACTH、CORT水平，发现抑郁症患者血清CRH、ACTH、CORT水平显著上升，提示抑郁症患者HPA轴功能亢进。

miRNA是一类长约22 bp的非编码单链小分子RNA，其在细胞内具有多种重要的调节作用。每个miRNA可以有多个靶基因，而几个miRNA也可以调节同一个基因，例如单个miRNA可调控多个基因的表达，多个miRNA联合作用，对某个基因的表达进行精细调控。miRNA可作用于相应靶基因miRNA，在神经发育、细胞增殖与分化、细胞凋亡等多种生命活动中发挥调控作用。多种miRNA可能参与了抑郁症的发生、发展。SMALHEISER等[10]对自杀身亡的抑郁症患者和非抑郁症死亡者后脑组织前额叶皮质中miRNA表达进行了检测，发现抑郁症患者21种miRNA表达水平明显降低。UCHIDA等[11]研究发现，在母婴分离大鼠前额叶中受抑制元素l-沉默转录因子4（REST4）调节的miRNA表达水平显著增高。本研究比较了健康者与抑郁症患者血清miR-18a表达水平，发现抑郁症患者血清miR-18a水平显著上升，提示miR-18a可能参与了抑郁症的发生、发展。

对HPA轴的调节主要依赖于糖皮质激素受体（GR）和盐皮质激素受体（MR）。GR和MR是保守的核受体超家族成员，属于核转录因子，被激活后通过与核内靶基因上的一段特定DNA序列结合，调控基因转录，发挥各种生物效应。MR参与基础水平HPA轴的负反馈调节，介导HPA轴基础活性的维持；而在机体做出“战斗或逃跑”反应时，GR主要参与应激状态下的高水平糖皮质激素的负反馈调节，抑制HPA轴过度激活，或使功能亢进的HPA轴恢复至基础水平。MR/GR的平衡对HPA轴功能活性具有关键调控作用。抑郁症患者GR数量和功能均低于健康者[12]，而GR是miR-18a的靶基因，miR-18a表达上调可抑制GR表达[13]。本研究中的相关性分析结果显示，抑郁症患者血清miR-18a表达水平与郁症患者HPA轴功能亢进呈显著正相关，其机制可能在于抑郁症患者miR-18a表达水平升高，抑制GR表达和功能，破坏MR/GR平衡，最终导致HPA轴的过度激活。

综上所述，抑郁症患者miR-18a表达水平显著升高，且其表达水平与HPA轴功能亢进密切相关，说明miR-18a有望成为抑郁症诊断及病情判断的分子标志物，值得进一步深入研究。