23 kDa亚型肝再生增强因子在肾纤维化过程中表达水平检测及意义研究*

夏 宁，颜如玉，廖晓辉，张 玲△（重庆医科大学附属第二医院：.风湿免疫科；.肾内科，重庆40000）

肝再生增强因子（ALR）是一种能促进肝脏再生、具有热稳定性和非特异性的生长因子，在肝脏、睾丸及肾脏中均有表达，并能自分泌到细胞外[1]。ALR有3种亚型，其中15 kDa ALR亚型主要存在于核内及胞质内[2-3]，21 kDa及23 kDa ALR亚型则主要定位于线粒体内膜系统，参与铁（Fe）和硫（S）离子的转运，维持铁硫蛋白（Fe/S蛋白）的生物活性及细胞Fe离子内稳态[4-5]。笔者所在课题组既往研究发现ALR在肾小管上皮细胞缺血再灌注损伤过程中具有抗凋亡作用，并且证实ALR通过减轻线粒体氧化应激损伤，发挥保护作用[6-7]。缺氧所造成的线粒体氧化损伤可导致肾小管功能受损，引起大量致纤维化因子的产生，并经多途径引起肾间质纤维化（RIF）[8]。因此，ALR有可能通过线粒体途径参与慢性肾小管间质损伤的病理生理过程及RIF进展过程。本实验拟通过转化生长因子β1（TGF-β1）诱导的人近端肾小管上皮细胞（HK-2细胞）上皮-间质转化（EMT）模型及单侧输尿管梗阻术（UUO）大鼠模型，通过分析细胞及组织中内源性ALR表达水平的变化，验证前述猜想，并为进一步研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要材料 HK-2细胞购自美国模式培养物集存库（ATCC），兔抗人ALR多抗体、兔抗大鼠甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体购自德国Santacruz公司，兔抗人钙黏附蛋白 E（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）单克隆抗体购自英国Abcam，高纯度总RNA提取试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司，RNA逆转录试剂盒、重组人TGF-β1购自美国R&D Systems公司，实时定量聚合酶链反应（PCR）试剂盒、异硫氰酸荧光素（FITC）标记羊抗兔IgG抗体购自中杉金桥公司，PCR扩增上、下游引物由华大基因公司合成。雄性SD大鼠20只，购自重庆医科大学实验动物中心，体重250～300 g。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及处理 HK-2细胞以含10%胎牛血清（FBS）的1640培养液37℃、5%CO2条件下贴壁培养，以0.25%胰酶消化，1∶3比例传代，细胞生长至70%～80%融合时，用无血清培养液同步化24 h，再行分组处理。空白对照组常规培养，不给予任何处理；TGF-β1刺激组（包括 TGF-β1处理终浓度 5、10、15 ng/mL 3个亚组）。培养12 h后收集细胞，用于ALR mRNA表达水平检测；48 h后再次收集细胞，用于免疫荧光及蛋白质印迹法（Western blotting）检测。

1.2.2 动物实验 将20只SD大鼠随机分为4组，每组5只，分为假手术组、3 d模型组、7 d模型组、14 d模型组。各模型组UUO手术方法：术前8 h大鼠禁食禁水，以10%水合氯醛麻醉，消毒后由大鼠左侧背部剪开皮肤，逐层分开肌肉，暴露左侧肾脏，沿肾盂部位钝性分离出左侧输尿管，于输尿管中上1/3处以4-0线双重结扎，切断输尿管。除不结扎及切断输尿管外，假手术组其他手术方法与模型组一致。于术后3、7、14 d处死大鼠，取肾组织，一部分保存于-80℃用于Western blotting检测，一部分以10%甲醛固定后用于组化染色检测。

1.2.3 组化染色检测 10%甲醛固定肾组织标本经常规脱水、包埋、切片后行Masson染色，随机选择5个互不重叠的肾小管间质视野，200倍光镜下观察，统计组织胶原染色阳性面积占整个视野面积的百分比，进行半定量分析。半定量判定标准参照Banff定量标准[1]：阳性面积小于5%为0分；阳性面积5%～25%判为轻度病变（1分）；阳性面积26%～50%判为中度病变（2分）；阳性面积超过50%为重度病变（3分）。分别由2名经验丰富的病理学专家独立计分，计算均值。

1.2.4 实时荧光定量PCR检测 提取收集到的HK-2细胞、肾组织总RNA，检测RNA浓度及鉴定RNA质量后，按逆转录试剂盒说明书要求进行逆转录，取cDNA产物，按每孔100 ng cDNA进行实时定量PCR扩增；反应体系为：2×SYBR Green 10.0 μL，50×Dye 0.4 μL，10 μmol/L 上、下游引物各 0.8 μL，cDNA 2.0 μL，无菌双蒸水补至20.0 μL；混匀、离心后上机检测，反应条件为：95℃ 30 s，95℃ 5 s、60℃ 31 s循环 40次，分析融解曲线。β-actin扩增上游引物序列：5′-TCA GGT CAT CAC TAT CGG CAA T-3′，β-actin 扩增下游引物序列：5′-AAA GAA AGG GTG TAA AAC GCA-3′；ALR 扩增上游引物序列：5′-CAG AAG CGG GAC ACC AAG TTT-3′；ALR扩增下游引物序列：5′-CAC ACT CCT CAC AGG GGT AA-3′。每份标本重复检测3次，每次设置3个复孔，计算均值作为最终结果；以β-actin为内参照物，采用2-△△t计算mRNA相对表达量。

1.2.5 Western blotting检测 采用蛋白裂解液处理肾组织及HK-2细胞，提取总蛋白，严格冰上操作；二辛可酸法（BCA法）测定蛋白浓度；高温变性后取20 μg蛋白样品，采用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺电泳（SDS-PAGE）法，80 V恒压电泳分离；将凝胶中的蛋白250 mA恒流转移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上；以含5%BSA的Tris缓冲盐及吐温-20（TBST）缓冲液室温封闭1 h，加入一抗4℃孵育过夜；洗膜后加入羊抗兔IgG二抗（1∶10 000）室温孵育 1 h，电化学发光法（ECL）显色；采用美国Bio-Rad公司Image Pro Plus 6.0软件分析各条带灰度值，计算均值作为最终结果。

1.2.6 细胞免疫荧光检测 将制作好的细胞爬片以4%多聚甲醛固定30 min，0.3%Triton-X100室温透膜5 min，山羊血清封闭30 min，兔抗人ALR多抗4℃孵育过夜；磷酸盐缓冲液（PBS）清洗，以FITC标记羊抗兔IgG二抗室温孵育1 h；PBS清洗，60%甘油封片，采用荧光显微镜观察ALR表达及分布情况。

1.3 统计学处理 采用SPSS19.0软件进行数据处理和统计学分析。计量资料以±s表示，组间均数比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），P＜0.05为比较差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 TGF-β1对细胞E-cadherin、Vimentin表达水平的影响 Western blotting检测结果显示，与空白对照组相比，TGF-β1刺激后细胞E-cadherin蛋白表达水平明显降低，Vimentin蛋白表达水平明显增加（P＜0.05）；TGF-β1处理24 h后，不同剂量TGF-β1处理组间E-cadherin、Vimentin蛋白表达水平比较差异无统计学意义（P＞0.05），见图1。

2.2 TGF-β1处理对EMT细胞模型23 kDa ALR表达水平的影响 TGF-β1处理12 h后，EMT细胞模型内源性23 kDa ALR mRNA表达水平较空白对照组明显增加（P＜0.05），但不同剂量TGF-β1处理组间比较差异无统计学意义（P＞0.05），见图2。Western blotting检测结果显示，EMT细胞模型内源性23 kDa ALR蛋白表达水平较低，TGF-β1处理48 h后，各处理组23 kDa ALR表达水平明显增加，与空白对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05），见图3。细胞免疫荧光检测结果亦显示TGF-β1处理可促进内源性23 kDa ALR蛋白的表达，以浆蛋白为主，见图4。

图1 Western blotting检测不同剂量TGF-β1处理细胞E-cadherin及Vimentin表达水平

图2 实时荧光定量PCR检测不同剂量TGF-β1处理EMT细胞模型24 h后23 kDa ALR mRNA表达水平

图3 Western blotting检测不同剂量TGF-β1处理EMT细胞模型23 kDa ALR蛋白表达水平

2.3 肾脏组织Masson染色结果 UUO模型组肾小管结构严重破坏，管腔塌陷，大量炎性细胞浸润，胶原成分明显增加。模型组肾纤维化病理评分高于假手术组（P＜0.05），见图5。

图4 免疫荧光检测不同剂量TGF-β1处理EMT细胞模型23 kDa ALR蛋白表达水平及分布（400×）

图5 UUO模型大鼠不同时间纤维化程度及病理评分

2.4 UUO模型大鼠肾组织ALR蛋白表达水平 Western blotting检测结果显示，假手术组大鼠肾组织23 kDa ALR表达水平较低，UUO术后3 d和7 d梗阻肾组织23 kDa ALR表达水平增加，与假手术组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；与UUO术后7 d比较，术后14 d梗阻肾组织23 kDa ALR表达水平降低（P＜0.05），见图6。

3 讨 论

图6 Western blotting检测UUO模型大鼠肾组织23 kDa ALR蛋白表达水平

RIF是各种病因导致肾功能逐渐衰竭进展至终末期肾病（ESRD）的主要病理变化及共同病理途径[9]。多种调控物质，包括生长因子、细胞因子、代谢毒素和应急分子等，通过复杂的机制和通路调节RIF进展过程。其中，TGF-β/Smad是公认的促进RIF最重要的细胞信号通路；TGF-β1可诱导肾小管上皮细胞发生EMT，促进成纤维细胞和肌成纤维细胞激活及聚集，从而发生RIF[10-12]。本研究结果显示，TGF-β1 处理 HK-2 细胞可促进上皮细胞发生表型转化，E-cadherin及Vimentin表达水平的改变，以及提高细胞内23 kDa ALR表达水平。有研究报道，ALR基因治疗可通过减轻线粒体损伤、增加三磷酸腺苷酶（ATP酶）的活性、抑制氧化应激和下调TGF-β1等，保护肝脏不受四氯化碳（CCl4）诱导的损伤和纤维化[13]。本课题组前期实验同样证实ALR可减轻线粒体氧化应激损伤[7]。而本研究发现，增加的23 kDa ALR主要定位于线粒体内膜系统[4]。表达与线粒体内膜系统的23 kDa ALR可调节黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）连接的巯基氧化酶活性，催化二硫键的形成[14]，并作为一种电子转移体存在于线粒体呼吸链。TGF-β1刺激后细胞23 kDa ALR表达增多，可能是通过增强细胞线粒体功能、增加ATP酶的活性，减轻TGF-β1刺激诱导的细胞表型转化。

在UUO模型大鼠中，同样观察到类似结果。在病程的不同阶段，内源性23 kDa ALR表达水平呈动态变化。在梗阻初期（术后7 d内），23 kDa ALR表达明显增加，至梗阻14 d后，23 kDa ALR表达减少。大鼠模型诱导的梗阻性肾病涉及炎症、氧化应激、脂质代谢、细胞凋亡、成纤维细胞增殖和活化等多种病理过程[15]。氧化应激导致的线粒体损伤及其介导的一系列代谢紊乱是梗阻性RIF的重要机制，其中氧化产物还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）及NADPH氧化酶（NOX4）在UUO术后第7天达到顶峰[16-17]。POLIMENO等[18]的研究发现，ALR能够调节细胞氧化应激，降低活性氧的产生，发挥抗凋亡作用。因此，定位于线粒体的23 kDa ALR表达水平增加可能参与了梗阻性肾病时肾脏氧化应激过程，但具体机制仍不清楚。

综上所述，本研究通过细胞和动物实验证实了23 kDa ALR在RIF过程中表达增加，并在其中发挥重要作用，为进一步研究ALR在肾纤维化中的作用及寻找更好的治疗措施奠定了一定的基础。