普鲁兰酶在制备麦芽糖浆中的应用研究

曹玉华，王关斌，李玉珍，杜瑞锋，黄伟红，李 杰

(山东福田药业有限公司，山东禹城 251200)

麦芽糖属于双糖类，它是白色针状结晶，高纯度结晶麦芽糖产品工艺复杂，目前国内市场上的麦芽糖产品主要是麦芽糖浆，根据麦芽糖含量的高低，麦芽糖浆可分为普通麦芽糖浆、高麦芽糖浆和超高麦芽糖浆。麦芽糖含量在60%以下的麦芽糖浆为普通麦芽糖浆，麦芽糖含量在60%～70%之间的为高麦芽糖浆，麦芽糖含量在70%以上的为超高麦芽糖浆。在我国，麦芽糖浆特别是超高麦芽糖浆的开发和应用越来越受到重视，特别是由于其具有熬糖温度高，抗结晶性好，不易返砂等特点，在糖果行业、糕点行业备受青睐。

普鲁兰酶是一种脱支酶，能够专一性切开支链淀粉分支点中的α－1，6糖苷键，是一种在低pH值下应用的热稳定脱支酶，普鲁兰酶与其他淀粉酶协同作用，使食品质量提高，降低粮耗，节约成本，减少污染。与糖化酶一起使用，可用液化淀粉浆来生产麦芽糖浆，但在目前的生产工艺中，需要添加其他酶制剂，多酶协同作用生产高麦芽糖浆，这不仅增加了成本，还给后序处理带来一定的困难，本文就是以淀粉液化液为原料，本着减少酶制剂使用量、降低成本的目的，研究了普鲁兰酶与β－淀粉酶双酶协同作用在酶解过程中对麦芽糖含量的影响，确定了普鲁兰酶与β－淀粉酶的最佳添加比例，制备出了较高含量的麦芽糖，具有一定的经济价值和社会效益。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

淀粉液化液，山东福田药业有限公司;普鲁兰酶1#、普鲁兰酶2#、β－淀粉酶，山东隆科特酶制剂有限公司;麦芽糖标准品(色谱级)，美国Sigma公司。

1.2 仪器与设备

水浴恒温振荡器，型号:SHA－C，江苏金坛市中大仪器厂;液相色谱仪，型号:CTO－20A，日本岛津公司。

1.3 方法

调液化液pH后，控制一定的酶解温度，添加一定量的β－淀粉酶，分别添加两种不同的普鲁兰酶1#、2#，比较两种普鲁兰酶的酶解效果。

1.3.1 取效果好的普鲁兰酶，进行单因素实验

1.3.1.1 β－淀粉酶添加量对麦芽糖含量的影响

取液化液，调pH值5.5后，加入1 kg/tds液化液的普鲁兰酶，控制酶解温度60℃，β － 淀粉酶添加量分别为0.5、1、1.5、2、2.5 kg/tds液化液进行酶解。

1.3.1.2 普鲁兰酶添加量对麦芽糖含量的影响

取液化液，调pH值5.5后，加入1kg/tds液化液的β－淀粉酶，控制酶解温度 60℃，普鲁兰酶添加量分别为 0.5、1、1.5、2、2.5 kg/tds液化液进行酶解。

1.3.1.3 酶解液pH值对麦芽糖含量的影响

取液化液，调 pH 值分别为 4.5、5.0、5.5、6.0、6.5 后，分别加入1 kg/tds液化液的普鲁兰酶和β－淀粉酶，控制酶解温度60℃，进行酶解。

1.3.1.4 酶解温度对麦芽糖含量的影响

取液化液，调pH值5.5，分别加入1 kg/tds液化液的普鲁兰酶和 β － 淀粉酶后，控制酶解温度分别为 45、50、55、60、65℃进行酶解。

1.3.2 正交实验设计

以单因素实验结果为依据，选取酶解pH值、温度、普鲁兰酶和β－淀粉酶添加量作为考察因素，每个因素拟定3个水平，进行4因素3水平正交实验，正交设计及因素见表1。

1.3.3 分析方法

麦芽糖含量的测定方法:高效液相色谱检测法。

1.3.4 色谱条件

1.3.4.1 色谱柱

色谱柱:00H－0130 －K0，300 ×7.8 mm，流速:0.6 mL/min。

1.3.4.2 标准溶液的配制

标准储备液的配制:称取色谱级麦芽糖标准品10.0 mg，用超纯水溶解后定容至10 mL，配成质量浓度1 mg/mL的储备液，于棕色瓶中4℃下储存。

标准溶液的配制:吸取一定量麦芽糖标准储备液用超纯水稀释10000倍，混合均匀保存在4℃下备用，使用前用0.45μm滤膜过滤。

样品处理:样品经4800 r/min离心10min除去蛋白质，取上清液稀释至一定浓度备用。使用前用0.45μm的滤膜过滤，进样量10μL。

1.3.4.3 麦芽糖标准品色谱图

见图1。

图1 麦芽糖标准品色谱图

2 结果与分析

2.1 普鲁兰酶的性能优选

表2 车间取液化液指标Table2 Indicators of liquid liquids taken in workshop

表3 两种普鲁兰酶的酶解效果Table3 Enzymolysis effect of two kinds of pullulanase

由表3可知，普鲁兰酶1#与β－淀粉酶双酶酶解淀粉液化液，其麦芽糖含量较高，效果较好。所以以下实验中均用普鲁兰酶1#与β－淀粉酶协同作用，考察其最佳酶解条件。

2.2 单因素实验

2.2.1 β－淀粉酶添加量对麦芽糖含量的影响

图2 β－淀粉酶添加量对麦芽糖含量的影响Fig.2 Effect ofβ －amylase addition on maltose content

图2 中结果显示在一定范围内随着β－淀粉酶添加量的增加，麦芽糖含量增加，在添加量为1.5 kg/tds时，麦芽糖含量达到最大，随着β－淀粉酶添加量的增加，麦芽糖含量反而降低，这可能是酶添加过量，导致单糖含量增加的缘故。

2.2.2 普鲁兰酶1#添加量对麦芽糖含量的影响

普鲁兰酶是一种脱支酶，能切断支链淀粉中的α－1，6糖苷键，添加普鲁兰酶能够使液化液充分酶解，提高麦芽糖产量，图3中结果显示在一定范围内随着普鲁兰酶1#添加量的增加，麦芽糖含量增加，当添加量大于1 kg/tds时，麦芽糖含量增加不明显，甚至有下降的趋势，从生产角度考虑，选择添加量为1 kg/tds比较合适。

图3 普鲁兰酶1#添加量对麦芽糖含量的影响Fig.3 Effect of adding amount of pullulanase 1#on maltose content

2.2.3 酶解液pH值对麦芽糖含量的影响

糖化酶是由优良菌种深层发酵而成的一种酶，需要在一定的pH值范围内才能保持活力，从图4可以看出，当pH值在4～5.5时，麦芽糖含量逐渐增高，到达pH值6时，麦芽糖含量突然下降，说明糖化酶在pH值5.5时，酶活力最强。

图4 pH值对麦芽糖含量的影响Fig.4 Effect of ph on maltose content

2.2.4 酶解温度对麦芽糖含量的影响

糖化酶需要在一定的温度范围内才具有活力，从图5可以看出，当温度在60℃时，麦芽糖含量最高。

图5 温度对麦芽糖含量的影响Fig.5 Effect of temperature on maltose content

2.3 正交实验结果

根据上述单因素实验，正交实验设计与结果如表4所示。

由表4的正交实验结果分析可知，各因素的影响情况为:pH值影响最大，β－淀粉酶添加量次之，温度和普鲁兰酶添加量影响小一些;影响麦芽糖含量的因素最优组合为A3B3C2D2。由此可以看出，酶解条件pH越温和，温度适中，越有利于麦芽糖的生成，为了实现麦芽糖含量的最大化，选用β－淀粉酶添加量在1.0～1.5 kg/tds之间，实验选用优化的工艺条件为pH值5.5、温度60℃、β － 淀粉酶添加量 1.3kg/tds、普鲁兰酶 1#添加量1.0 kg/tds，在此条件下，对10 kg液化液进行酶解，得到的酶解液麦芽糖含量为78.768%。

表4 液化液酶解正交设计实验表Table4 Experiment table of orthogonal design for enzymatic hydrolysis of liquefied liquid

3 结论

利用普鲁兰酶1#对液化液进行酶解，能够得到麦芽糖含量较高的酶解液，其优化的工艺条件为:pH值5.5、温度60℃、β－淀粉酶添加量1.3 kg/tds、普鲁兰酶添加量1.0 kg/tds，在此条件下，酶解淀粉液化液，能够得到麦芽糖含量为78.768%的酶解液。