长寿命BOD微生物传感器的研制及应用

孙好芬，王 露，高玉玺，刘 宇，赵炳彦

(青岛理工大学环境与市政工程学院，山东青岛266033)

在水质评价中，生化需氧量是目前衡量水质有机污染常用的重要指标。目前广泛应用的BOD5测定方法是标准稀释法［1］，操作复杂、耗时耗力，不利于大批量样品的分析。而对于库仑滴定法、差压法、活性污泥法和相关计算法等［2－3］，前两种方法也不能缩短时间，后两种方法又有较大的局限性，因此也不能满足实际要求，且不能及时反映排放水的污染程度，因而无法进行现场监控。由此，实际工作中迫切需要一种操作简单、准确快速、自动化程度高、应用范围广的新方法测定BOD，智能型BOD快速测定仪就是在此迫切要求下产生的一种集微生物学与现代电子技术于一体的高新技术产品。国内外已有文献［4－5］报导，日、美、英、德等国家已有商品化的生物传感器快速测定仪，且日本已制定了有关生物传感器测定BOD的工业标准［6］。我国已在2009年《水质·生化需氧量BOD的测定(HJ05－2009)》一文中也已明确规定使用微生物传感器快速测定法。所以，将快速生物传感器监测技术和方法引入环境水处理领域，将多学科的最新技术进行交叉组合，开发新型的水质分析和废水处理过程的监测仪器是一个必然的发展趋势。

1 实验材料与微生物传感器的制备

1.1 菌种

采用具有高效单一菌种(自行分离、培养、提纯，未鉴定)。

1.2 试剂

(2)BOD标液:中国环境监测总站－－将葡萄糖和谷氨酸各150mg溶解并定容至100 mL，其BOD值为(2000±370)mg/L。

1.3 仪器

LY－07型BOD智能生物检测仪;恒温生化培养箱;恒温( ±0.1℃)摇床;离心机。

1.4 微生物膜的制备

1.4.1 菌种的培养

取青岛某药厂废水，充分振荡、静置，取少量富含高效菌种的上清液接种于培养基中，在(37±1)℃条件下振荡培养48h，冷却，再以4500r/min的转速离心5min，得到湿菌体。用0.9%的NaCl液清洗2次，分离，再接种到100 mL的培养基中，进行培养，得到乳白色湿菌体后置于冰箱中4℃保存，备用。

1.4.2 微生物膜的制备

所选择的微生物敏感材料是对污水中有机物有较强分解代谢能力的微生物，在保持微生物活性的前提下，取一定量的湿菌体与一定量的聚乙烯醇溶液混合，均匀地涂在0.45μm的滤膜上，并加以固定，构成固定化微生物膜。

1.5 微生物膜的活化

微生物膜保存于0～4℃条件下，使用前用蒸馏水清洗后安装在电极上，浸泡于缓冲溶液中1～2d，加入适量BOD标准溶液，开机活化1d。

1.6 仪器工作参数

测量时长为15min;BOD标液:(2000±370)mg/L。

而夏天，听着外面猛烈的雨声，心里渐渐感觉到了局促，什么时候才可以走呢？外面有没有公交车？即使有公交车，这个遥远而陌生的地方，他能够顺利地回去吗？晓晓是他心目中的女神，这是他和她单独相处的第一个晚上，他不能冒犯她，他不能唐突她，如果不走，他可以做到吗？

2 实验结果

2.1 微生物的筛选

目前国内外研制的BOD传感器多用单一菌种［7－10］:丁酸梭菌、假单孢菌［7］、异常汉逊氏酵母菌［8］、皮状丝孢酵母菌［9］、芽孢杆菌［10］等，与我们自行培养的高效菌种相比较，结果表明:经特殊水质的废水分离、提取，然后再次培养的微生物(未经鉴定)纯度和活性较高，寿命长，通用性也较强，可以测定生活污水和某农药、化工废水的BOD值，并且使用时间长达12个月，具有前述菌种所无法比拟的优越性。而采取长期驯化菌种废水［11］接种获得的微生物菌种，测定结果重复性不高，精密度差，主要原因可能是由于驯化废水中菌类的种类和数量不稳定，微生物分布不均匀。

2.2 生物膜的制备

细胞固定化最常用的方法是包埋。利用凝胶包埋、树脂吸附固定以及交联等固定化技术进行比较［12］，确定以吸附包埋固定化技术比较适宜于器材的大批量生产，并且测定线性范围较广。将已培养成功的微生物固定在聚乙烯醇凝胶中，再用超滤膜制成片状微生物薄膜。此薄膜在常温条件下包埋，机械强度、韧性、透气性均交好，且易于更换，使用方便、快速。

2.3 微生物膜的使用寿命

由文献［13－14］数据可知，由酵母菌研制的BOD微生物传感器的线性响应范围为0～200mg/L，响应时间为15min，稳定地工作寿命在3个月以上;大肠杆菌BOD微生物传感器在0～500mg/L的BOD浓度范围内具有很好的线性关系，工作寿命略长，在4～6个月以上，其线性相关系数可达到0.99以上，响应时间缩短为12min内。而LY－07微生物薄膜线性响应范围可达2～4000 mg/L，响应时间低于为8min，使用寿命30d以上，甚至可长达12个月，是迄今文献报道中使用寿命最长的BOD微生物薄膜，推测可能与微生物膜的机械强度和性能较高以及微生物菌种的类型有关。

2.4 仪器工作参数的校正方式

仪器工作参数采用单点多次校正。

2.5 仪器的准确度及精密度

2.5.1 准确度

根据中国环境监测总站提供的标准样品进行检验，结果如表1所示。

表1 准确度检验

2.5.2 精确度

根据中国环境监测总站规定的标准，采用谷氨酸和葡萄糖各150 mg溶解并定容至100 mL，其BOD值为(2000±370)mg/L，连续测定8次，结果如表2所示。

表2 精确度检验

由准确度及精密度可以发现，LY－07型BOD智能生物检测仪测量的准确度与精确度较好。

2.6 仪器的测定周期

LY－07型BOD智能生物检测仪的测定周期较短，响应时间最多不超过10min，一般为3～5min，洗脱时间为15min左右(并且现在洗脱时间也在大大缩短，5min时亦可获得较好数据，见表3)。总之，一般均可在25min内完成样品的测定。

表3 洗脱时间对实验结果的影响

由此可见，对于某些水样，减少洗脱时间，对实验结果影响不大。

2.7 在实际工作中的应用

工业废水BOD测定结果的对比见表4。

表4 工业废水BOD测定结果的对比

由表4可以看出，仪器法测定废水中的BOD与稀释倍数法有着较好的一致性。

为了检验仪器的精密度，我们分别对第二毛纺厂和第四啤酒厂的废水进行了测定，结果如表5所示。

表5 仪器的精密度检验结果

3 讨论

本研究制备的LY－07型BOD微生物膜传感器，采用了优良菌种及利于微生物生存和新陈代谢的固定化方法，与报道的同类研究相比较，具有使用寿命长，微生物膜机械强度和性能好，易于多次更换使用，测定周期短(可减少洗脱时间)，且具有较高的准确度和灵敏度等特点。在环境监测的实际应用中，与经典的碘量法相比较，具有较好的相关性，结果表明:LY－07型BOD微生物膜传感器的研发及其在环境监测中的使用是具有实际意义的，使BOD在线监测即将广泛应用。