PPARα激活保护小鼠急性肝衰竭对CHOP的调节作用研究

房忠军， 徐 玲,2， 田 原,2， 靳海英， 时红波,2， 任 锋,2， 张向颖,2

1.首都医科大学附属北京佑安医院检验科，北京 100069； 2.北京市肝病研究所

急性肝功能衰竭(acute liver failure, ALF)是一种炎症介导的肝细胞损伤过程，是由肝细胞凋亡和出血性坏死引起的临床综合征[1]。目前除肝移植外仍缺乏有效治疗手段，因此其肝脏损伤发生的分子机制亟待探讨。

内质网应激作为内源性凋亡通路之一，在炎症反应及细胞凋亡调节方面均发挥着重要作用。内质网应激特异性凋亡蛋白CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(C/EBP homologous protein, CHOP)是一种转录因子，在内质网过度应激过程中激活并在内质网应激诱导的凋亡细胞死亡中发挥重要作用[2]，但其分子调控机制尚不明确。而过氧化物酶体增殖物激活受体α(peroxisome proliferator activated receptor alpha, PPARα)在调节脂质代谢[3]、细胞分化和凋亡[4]等方面均发挥着重要作用。本研究旨在探讨PPARα信号分子是否通过CHOP参与了ALF中内质网应激诱导肝细胞凋亡。

1 材料与方法

1.1实验材料健康C57BL/6小鼠，雄性，8～12周龄，体质量18～25 g，购自军事医学科学院，在北京市肝病研究所饲养，实验前12 h和实验期间禁食，自由饮水。Wy-14643(PPARα特异性激活剂)、D-氨基半乳糖(D-Galactosamine, D-GalN)和脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)购自美国Sigma公司。内质网应激特异性凋亡蛋白CHOP和β-actin兔抗单克隆抗体，以及辣根过氧化酶(horseradishperoxidase, HPR)偶联的羊抗兔多克隆抗体均购自美国Cell Signaling 公司；PPARα多克隆抗体购自美国Abcam公司；增强化学发光试剂盒购自美国Thermo公司；蛋白定量试剂盒购自美国Bio-Rad公司，实时荧光定量PCR(quantitative real-timepolymerase chain reaction, qRT-PCR)试剂盒和Trizol试剂均购自美国Invitrogen公司。

1.2实验方法

1.2.1 ALF模型的建立：C57BL/6小鼠腹腔注射D-GalN(700 mg/kg)和脂多糖(LPS，10 μg/kg)，6 h后模型建立，水合氯醛麻醉小鼠，留取血液和肝组织进一步检测。

1.2.2 动物实验分组：为研究内质网特异性凋亡蛋白CHOP分子和PPARα分子在ALF过程中的动态表达，将模型组分为D-GalN/LPS给药后2 h、4 h和6 h三组。为观察PPARα对ALF小鼠肝脏组织中CHOP信号分子的影响，将实验动物分为对照组(给予相应量的生理盐水)、模型组(D-GalN/LPS腹腔注射6 h)、Wy-14643干预组(造模前2 h以6 mg/kg尾静脉注射)、siRNA对照组(转染阴性对照质粒)和PPARα siRNA干预组(造模前24 h以3 mg/kg尾静脉注射)。

1.2.3 病理学检测：常规石蜡包埋、切片、苏木精-伊红(hatmatoxylin-eosin, HE)染色、光学显微镜观察肝组织损伤情况。

1.2.4 血清肝功能检测：采用全自动生化分析仪，利用血清转移酶检测试剂盒测定小鼠血清中丙氨酸氨基转移酶(alanine transaminase, ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase, AST)水平。

1.2.5 实时荧光定量PCR检测：用Trizol试剂提取肝组织总RNA，具体操作按照说明书进行；测定总RNA浓度，用SuperScript Ⅲ Platinum Two-step QRT-PCR试剂盒合成cDNA，随后进行实时荧光定量PCR检测，具体操作按试剂盒说明书进行，以次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(hypoxanthine phosphoribosyltransgerase, HPRT)作为内参，检测肝组织中PPARα、CHOP基因表达水平。

1.2.6 蛋白印迹检测：取小鼠肝组织，加入100 μl预冷的组织裂解液，冰浴下充分匀浆，10 000 r/min 4 ℃离心5 min，取上清液进行蛋白质浓度测定；经十二烷基苯磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，4 ℃转膜(聚偏二氟乙烯膜)过夜，4 ℃孵育一抗(PPARα、CHOP、β-actin，1∶1 000)，Tris缓冲盐溶液漂洗3次，孵育二抗(1∶2 000稀释)，洗膜3次后，电化学发光试剂A液、B液混匀孵育，压片曝光。

1.2.7 免疫荧光检测：肝组织冰冻切片冰甲醇固定后，质量浓度为1 g/L Triton X-100打孔，加入质量浓度为100 g/L羊血清加盖玻片孵育20 min，再加入CHOP兔单克隆抗体4 ℃过夜，加入Alexa Fluor®568羊抗兔IgG(1∶200稀释)孵育45 min，PBS漂洗3次，DAPI染核10 min。Nikon Eclipse E800 荧光显微镜下观察。

2 结果

2.1ALF小鼠进展中肝组织病理及肝功能水平的变化正常小鼠肝脏体积正常，鲜红色，表面光滑，边界整齐，组织切片显示,肝细胞形态结构完整，未见细胞变性、坏死及炎性细胞浸润等。D-GalN/LPS干预2 h后肝组织出现轻微病变，切片可见少量红细胞浸润，4 h后肝组织充血严重，病理损伤加重，6 h后肝组织严重淤血，切片可见肝细胞大量出血坏死，炎症细胞浸润(见图1)。血清转氨酶检测结果与病理改变相对应，随着ALF进展，ALT、AST数值逐渐升高，4 h后转氨酶水平显著增加，肝功能受损明显加重(见图2)。

2.2PPARα和CHOP分子在D-GalN/LPS诱导的ALF小鼠进展中的动态变化首先评估PPARα和CHOP基因及蛋白在D-GalN/LPS诱导的ALF发展过程中的表达趋势。伴随肝脏损伤，与正常小鼠相比，PPARα mRNA水平逐渐下调；同时，CHOP mRNA在4 h后显著上调(见图3)，PPARα和CHOP蛋白表达趋势与基因水平一致，ALF小鼠中PPARα水平下降，而CHOP表达增加(见图4)。

2.3PPARαsiRNA的作用验证为了检查PPARα对D-GaIN/LPS诱导的小鼠ALF中CHOP表达的影响，使用Wy-14643激活PPARα和特异性siRNA来敲低PPARα。通过小鼠中PPARα水平的降低证实了体内PPARα特异性siRNA的抑制(见图5)。

图1 D-GalN/LPS诱导ALF的病理学改变(200×)Fig 1 Pathological changes in ALF induced by D-GalN/LPS (200×)

图2 D-GalN/LPS诱导ALF进程中ALT和AST水平变化Fig 2 Changes of ALT and AST levels in the process of ALF induced by D-GalN/LPS

图3 PPARα和CHOP在D-GalN/LPS诱导ALF进程中的基因表达

图4 PPARα和CHOP在D-GalN/LPS诱导ALF进程中的蛋白表达

图5 PPARα siRNA干预后的蛋白表达

2.4PPARα对D-GalN/LPS诱导的ALF中CHOP表达的调节作用与D-GalN/LPS处理的ALF相比，通过用Wy-14643预处理，CHOP的基因和蛋白质表达显著降低，此外，PPARα siRNA进一步增加CHOP水平(见图6、图7)。肝组织的免疫荧光染色也证实了这些改变(见图8)。结果显示，在D-GaIN/LPS诱导的ALF期间，PPARα降低促进CHOP的表达。

图6 激活或抑制PPARα后CHOP的蛋白表达水平

图7 激活或抑制PPARα后CHOP的基因表达水平

图8 激活或抑制PPARα后CHOP的荧光表达水平(400×)Fig 8 Fluorescence expression of CHOP after activation or inhibition of PPARα (400×)

3 讨论

ALF有多种病因，包括病毒感染、对乙酰氨基酚损伤、酒精摄入过量、代谢性肝病和其他原因仍然未知。它是通过细胞凋亡与大量肝细胞死亡有关，但确切的机制尚未完全明确。细胞凋亡是由基因控制的细胞自主的有序的死亡，涉及一系列基因的激活、表达及调控等的作用，通过内在和外在的凋亡信号传导途径，诱导特定的级联信号。

ALF中，长期或严重的内质网应激可触发细胞凋亡和凋亡介质相关的细胞死亡。转录因子CHOP是具有良好表征的促凋亡调节因子。前期研究表明，CHOP在GalN/LPS诱导的ALF中显著上调，并且在介导内质网应激诱导的细胞凋亡中起关键作用[5]，而CHOP沉默后肝细胞酒精性肝病中的细胞凋亡减少[6-7]。D-GalN/LPS诱导的ALF中CHOP水平显著升高，表明内质网应激介导的肝细胞凋亡在ALF机制中的重要作用[8]。

PPARs是核激素受体家族中的配体激活受体，在不同的物种中已经发现了3种亚型，控制许多细胞内的代谢过程，属于配体诱导核受体。其中，PPARα在肝脏、骨骼肌、肾脏、心脏和血管壁中高度表达，在脂肪和软骨中的表达量相对较低。有文献[9]表明，PPARα激活增加细胞凋亡改变肿瘤微环境，在肝细胞、血管平滑肌细胞或肾细胞中，PPARα激活可抑制各种刺激诱导的细胞凋亡[10-11]。

本研究结果表明，在ALF小鼠的发展过程中，CHOP和PPARα基因和蛋白表达呈现相反的趋势，我们通过激动剂Wy-14643激活PPARα后下调了CHOP表达，PPARα敲低后增加了ALF小鼠的CHOP水平，而CHOP蛋白被认为是ER应激相关细胞凋亡的关键介质[12]，提示激活PPARα可以调节内质网应激介导的细胞凋亡，发挥对肝衰竭的保护性作用。因此，我们认为PPARα是一种新的参与内质网应激和细胞凋亡的信号分子，对ALF可能具有潜在的治疗作用。