HPI-4对胃癌细胞生长的抑制作用及其机制

李朝辉， 韩保卫， 刘帅峰， 王云帅

郑州大学附属洛阳中心医院肠胃外科，河南 洛阳 471009

胃癌是一种常见的发生于胃黏膜上皮细胞的消化道恶性肿瘤，是全球癌症致死的第二大原因。调查数据显示，胃癌新发病例约为95.2万，而中国占其总数的42%，严重威胁着我国人民的身体健康和生活质量[1]。由于胃癌早期诊断和治疗的手段不理想，大部分患者确诊时多为晚期，单纯的手术治疗、放疗和化疗等手段未能显著提高胃癌的总生存率，寻找新的治疗方法和开发新的治疗药物是改善胃癌治疗效果的迫切需要。随着对胃癌研究的不断深入，对胃癌的发生、发展的作用机制也有所了解，主要与相关基因的突变或异常表达、微小RNA的异常调控和主要信号通路的激活等密切相关，其中，信号通路的异常激活在胃癌发生、发展过程中发挥着关键作用[2]。Hedgehog(Hh)信号通路是一种与胚胎的生长发育密切相关的保守信号通路，在胰腺癌、膀胱癌和肝癌等多种肿瘤组织中异常活化，并参与肿瘤细胞增殖、侵袭及凋亡等生理过程[3-5]。研究已证实，Hh信号通路在胃癌的发生、发展过程中发挥着重要的调控作用，因此抑制或阻断Hh信号通路对胃癌治疗靶向药物的研究具有重要意义[6-7]。HPI-4作为Hh信号通路的小分子阻断剂之一，近年来引起学者们的关注，而其在胃癌中的研究报道较少。本研究通过体外实验观察HPI-4对胃癌BGC-823细胞增殖、侵袭、凋亡及其对GLI1、Cyclin D1和Bcl-2蛋白表达的影响，了解Hh信号通路在胃癌中的作用及机制，为HPI-4在胃癌中应用奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1细胞系、试剂和仪器Hedgehog信号通路抑制剂HPI-4购自美国Sigma公司，胃癌细胞系BGC-823购自中国科学院上海生物细胞研究所，RPMI-1640培养液、胰蛋白酶、青链霉素、二甲基亚砜和放射免疫沉淀法(Radio-Immunoprecipitation Assay, RIPA)裂解液购自美国Gibco公司，胎牛血清购自杭州四季青公司，GAPDH单克隆抗体、GLI1多克隆抗体、Cyclin D1单克隆抗体、B细胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia-2,Bcl-2)单克隆抗体和辣根过氧化物酶HRP标记抗鼠或抗兔IgG(IgG-HRP)二抗均购自武汉博士德公司。磷酸盐缓冲液(PBS)、trizol试剂、四甲基偶氮唑盐[3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT]检测分析试剂盒、膜联蛋白V-FITC(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)细胞凋亡检测试剂盒购自上海碧云天生物技术公司，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)、聚氰基丙烯酸正丁酯(bicinchonininc acid，BCA)蛋白定量检测试剂盒和ECL试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司， 酶标仪和流式细胞仪均购自美国BD公司，电泳仪购自北京六一仪器厂，CO2培养箱购自美国赛默飞世尔公司。

1.2方法

1.2.1 细胞培养：在灭菌RPMI-1640培养基(质量浓度为100 g/L的胎牛血清、100 μg/L链霉素和100 U/L青霉素)中接种复苏后的胃癌BGC-823细胞，置于温度为37 ℃，体积分数为5%的CO2，湿度为95%的CO2培养箱常规培养，待细胞完全铺满培养皿时，加入质量浓度为2.5 g/L胰蛋白酶消化传代。

1.2.2 增殖实验：在96孔细胞板上，每孔中加入含1×104ml-1BGC-823细胞2 000 μl ，将其分为对照组(0 μmol/L)和浓度分别为20、40和80 μmol/L的HPI-4实验组，每组设5个平行孔。当细胞完全贴壁后，根据实验分组依次加入制备好的HPI-4溶液100 μl，其中对照组加入等体积的培养液，分别在处理24、48和72 h后，每孔加入MTT溶液20 μl ，避光培养4 h后，弃培养液，加入200 μl二甲基亚砜，待紫色晶体溶解后，上酶标仪测570 nm处的吸光值(OD值)，计算出相应浓度的细胞抑制率，计算公式为：细胞抑制率(%)=100%×(对照组OD-实验组OD)/对照组OD。其中，每个浓度组均重复3次。

1.2.3 侵袭实验：取对数生长期的BGC-823细胞，调整细胞浓度为5×104ml-1，以每孔2 ml接种于24孔细胞板上，于37 ℃、体积分数为5%的CO2常规条件下培养24 h后，按照1.2.2中的分组以HPI-4处理BGC-823细胞，处理4 h后，继续培养48 h。在直径为8 μm的Transwell的聚碳酸酯膜上铺50 μl Matrigel基质胶，37 ℃聚合2 h，每个Transwell上室加入5×104个细胞，下室加入600 μl 质量浓度为100 g/L胎牛血清的DMEM培养基，培养24 h后，取出Transwell。以棉签除去上室的细胞及Matrigel基质胶，37 ℃室温下以质量浓度为40 g/L的多聚甲醛固定30 min。弃固定液，以质量浓度为5 g/L结晶紫染色，清洗后随机选取5个视野在显微镜下观察穿膜细胞，计细胞数。其中，每个浓度设3个重复，取平均值。

1.2.4 凋亡实验：收集对数生长期的BGC-823细胞，以1×105ml-1细胞浓度，每孔100 μl 接种于96孔板上，加入0、20、40和80 μmol/L的HPI-4处理48 h后，根据凋亡细胞检测试剂盒说明书，先加入500 μl 结合缓冲液，取1 ml浓度为1×105ml-1的细胞悬液，离心去培养基后，加入5 μl Annexin-V和10 μl PI进行双染色，混匀后室温避光反应30 min后，上流式细胞仪观察HPI-4对BGC-823细胞凋亡的影响。其中，每个浓度组重复3次。

1.2.5 蛋白检测：收集经不同浓度(0、20、40和80 μmol/L)HPI-4处理48 h的各组细胞，加入RIPA裂解液提取细胞各组细胞的总蛋白，BCA法检测其纯度及浓度。将蛋白样品在沸水浴锅中处理5 min后，取变性后的50 μg样品蛋白，每组实验重复3次，以SDS-PAGE凝胶电泳，电泳完毕后，转膜，以封闭液(含质量浓度为50 g/L的脱脂奶粉)处理2 h后，加入GLI1(1∶500)、Bcl-2(1∶800)、Cyclin D1(1∶500)和GAPDH(1∶1 000)一抗，4 ℃下反应24 h后，洗膜，加二抗(1∶2 000)于常温下孵育2 h，以ECL显色，GAPDH为内存，采用Image pro plus V6.0软件分析GLI1、Bcl-2和Cyclin D1蛋白的相对表达量。

2 结果

2.1HPI-4对胃癌增殖的影响采用MTT法检测不同浓度的HPI-4处理胃癌BGC-823细胞24、48和72 h后细胞的增殖情况见表1。在同一作用时间下，随着HPI-4浓度的增加，BGC-823细胞的增殖抑制率增高(P<0.05)；在同一浓度的HPI-4处理下，随着时间的延长，BGC-823细胞的增殖抑制率也增高(P<0.05)。HPI-4呈时间-剂量依赖性抑制BGC-823细胞的增殖。

表1 HPI-4对胃癌BGC-823细胞增殖的影响Tab 1 The effect of HPI-4 on the proliferation of gastric %

注：a：与20 μmol/L组相比，t40-24 h=6.598，P=0.003，t80-24 h=10.716，P=0.000，t40-48 h= 3.952，P=0.017，t80-48 h=13.565，P=0.000；t40-72 h=4.813，P=0.009，t80-72 h=12.007，P=0.000；b：与40 μmol/L相比，t24 h=7.500，P=0.002，t48 h=7.977，P=0.001；t72 h=8.881，P=0.001。

2.2HPI-4对胃癌细胞侵袭的影响如表2所示，与对照组相比，经20、40和80 μmol/L不同浓度HPI-4处理过的侵袭细胞数显著减少(P<0.05)，且随着HPI-4浓度的增加，侵袭细胞数逐渐减少(P<0.05)。

HPI-4呈浓度依赖性抑制BGC-823细胞侵袭。

表2 HPI-4对胃癌BGC-823细胞侵袭的影响Tab 2 Effect of HPI-4 on invasion of gastric cancer

注：*：与0 μmol/L相比，t=5.142，P=0.007；#：与20 μmol/L相比，t=8.365，P=0.001；△：与40 μmol/L相比，t=8.196，P=0.001。

2.3HPI-4对细胞凋亡的影响20、40和80 μmol/L浓度的HPI-4处理BGC-823细胞48 h后，采用流式细胞仪检测BGC-823细胞的凋亡率，分别为(11.35±2.18)%、(18.76±2.92)%和(25.15±4.26)%(见图1)。与对照组的细胞凋亡率(6.58±1.22)%比较，20、40和80 μmol/L组细胞的凋亡率均显著升高，差异有统计学意义(t1=3.307，P1=0.030；t2=6.666，P2=0.003；t3=7.259，P3=0.002)，且随着HPI-4浓度的增加，BGC-823细胞的凋亡率增高。HPI-4呈浓度依赖性诱导细胞凋亡。

图1 不同浓度的HPI-4对BGC-823细胞凋亡的影响 1：对照组；2：20 μmol/L组; 3：40 μmol/L组;4：80 μmol/L组Fig 1 Effects of different concentrations of HPI-4 on apoptosis of BGC-823 cells 1:control group; 2:20 μmol/L group;3:40 μmol/L group; 4:80 μmol/L group

2.4HPI-4对胃癌细胞中GLI1、CyclinD1和Bcl-2的影响20、40和80 μmol/L浓度的HPI-4处理BGC-823细胞48 h后，Western blotting检测各组细胞中GLI1、Cyclin D1和Bcl-2蛋白相对表达情况。与对照组相比，20、40和80 μmol/L组细胞中GLI1、Cyclin D1和Bcl-2蛋白相对表达量均显著降低，且随着HPI-4浓度的增加而降低，差异均有统计学意义(P<0.05)(见图2、表3)。

图2Westernblotting检测结果1：对照组;2：20 μmol/L组;3：40 μmol/L组;4：80 μmol/L组

Fig 2 Results of Western blotting detection 1: control group;2: 20 μmol/L group; 3: 40 μmol/L group; 4: 80 μmol/L group

注：*：与0 μmol/L相比，GLI1：t1=3.132，P1=0.014；t2=7.403，P2=0.000；t3=11.390，P3=0.000；Cyclin D1：t1=2.871，P1=0.021，t2=6.626，P2=0.000，t3=12.148，P3=0.000；Bcl-2：t1=3.226，P1=0.012，t2=7.143，P2=0.000，t3=10.600,P3=0.000; #：与20 μmol/L相比，GLI1：t1=4.271，P1=0.003；t2=8.258，P2=0.000；Cyclin D1：t1=3.755，P1=0.006，t2=9.276，P2=0.000，Bcl-2：t1=3.917，P1=0.004，t2=7.374，P2=0.000；△：与40 μmol/L相比，GLI1：t1=3.987，P1=0.004；Cyclin D1：t2=5.522，P2=0.001；Bcl-2：t3=3.456，P3=0.009。

3 讨论

HPI-4是Hh信号通路抑制剂家族中的一员，通过与有感受器功能的初始纤毛细胞相互作用，进而在肿瘤细胞中发挥抗肿瘤的功效。HPI-4区别于Hh信号通路的环巴明、GANT61和GANT51等其他抑制剂，它可能与肿瘤组织周围环境及肿瘤组织基质的关系不十分密切，通过与细胞外微环境的作用参与细胞增殖、侵袭和凋亡等过程。秦晓洋等[8]研究指出，25、50、100和200 μmol/L HPI-4处理上皮卵巢癌A2780后，HPI-4能够呈浓度依赖性抑制A2780细胞的增殖并诱导细胞凋亡。XIANG等[9]经5 μmol/L和10 μmol/L HPI-4处理软骨肉瘤SW1353细胞发现，HPI-4能够呈浓度依赖性抑制SW1353细胞的增殖和侵袭。目前，关于HPI-4对胃癌细胞生长的研究报道较少。本研究以BGC-823细胞为研究对象，通过观察经20、40和80 μmol/L HPI-4处理后细胞的增殖、侵袭和凋亡的情况，研究其对胃癌生长的抑制作用。MTT检测发现，不同浓度的HPI-4处理BGC-823细胞后，HPI-4能够呈浓度依赖性抑制BGC-823细胞的增殖和侵袭，流式细胞仪检测结果发现，HPI-4能够呈浓度依赖性诱导BGC-823细胞的凋亡。提示，Hh信号通路在胃癌细胞的增殖、侵袭和凋亡等生理过程中发挥着重要作用，Hh信号通路阻断剂HPI-4有望成为治疗胃癌的靶向药物。

核转录因子GLI家族是Hh信号通路的重要组成部分，位于Hh信号通路下游，通过与启动子结合而激活靶基因转录发挥调控作用。GLI1蛋白是GLI家族蛋白中的重要成员，在细胞中发挥着激活功能[10]。G1/S期是细胞增殖周期的重要关卡，Cyclin D1是一种G1期细胞周期蛋白，是驱动G1期进入S期的重要正调控因子[11]。Bcl-2蛋白家族是细胞凋亡过程中重要的调控因子，与细胞凋亡的线粒体途径密切相关，Bcl-2作为Bcl-2家族的中的凋亡抑制基因，通过拮抗促凋亡基因或抑制促凋亡基细胞色素C的释放或维持细胞中钙的稳态等多种途径，在细胞的凋亡过程中发挥着重要作用[12]。GLI1蛋白的异常表达是Hh信号通路激活的重要标志之一，Cyclin D1异常是细胞增殖周期失调的重要因素，Bcl-2是反映细胞凋亡的重要指标，三者均与胃癌的发生、发展密切相关。魏青林等[13]和LU等[14]检测GLI1在胃癌患者中的表达及与临床病理特征发现，GLI1在胃癌组织中表达呈高表达，且与胃癌患者预后不良密切相关。SHAN等[15]和朱玉侠等[16]研究指出，Cyclin D1和Bcl-2过度表达与胃癌恶性分化及预后的关系密切。Cyclin D1和Bcl-2是GLI1基因下游的相关靶基因，一旦Hh信号通路被激活或阻断，GLI1、Cyclin D1和Bcl-2的表达也会发生改变。为了进一步探讨HPI-4对胃癌的作用机制，本研究通过Western blotting检测不同浓度HPI-4处理BGC-823细胞后细胞中GLI1、Cyclin D1和Bcl-2蛋白的表达变化，结果发现，GLI1、Cyclin D1和Bcl-2蛋白相对表达均呈浓度依赖性显著降低。结果提示，HPI-4可能通过下调GLI1蛋白表达抑制Hh信号通路活化，GLI1蛋白下调导致Cyclin D1和Bcl-2蛋白表达下调，干扰胃癌细胞周期，最终抑制BGC-823细胞增殖和促进细胞凋亡。

综上所述，Hh信号通路在胃癌的发生、发展过程中发挥着重要作用，Hh信号通路阻断剂HPI-4可能通过下调GLI1蛋白的表达抑制Hh信号通路的激活，进而抑制Cyclin D1和Bcl-2蛋白的表达，引起胃癌BGC-823增殖和侵袭受阻，细胞凋亡增加。HPI-4的研究目前还较少，具体的作用机制还有待更多、更深入的研究。本研究以HPI-4为Hh信号通路靶向药物治疗胃癌的研究奠定了理论基础，为HPI-4在胃癌治疗方面的应用提供了参考依据。