富马酸替诺福韦二吡呋酯中6种有关物质高效液相色谱测定方法改进

程 诚，杨智慧

（江苏省连云港市食品药品检验检测中心，江苏 连云港 222000）

富马酸替诺福韦二吡呋酯是美国Gilead Sciences公司研制的新型核苷酸逆转录酶抑制剂，临床主要用于治疗人类免疫缺陷病毒（HIV）感染[1－4]；同时可通过干扰乙型病毒型肝炎（简称乙肝）病毒DNA聚合酶的功能而抑制乙肝病毒的复制[5]，降低血清及肝组织内的病毒载量。目前关于该药的质量分析已有研究报道[6－12]，有关物质一般采用高效液相色谱（HPLC）法进行检测[13－15]。本研究中对该药生产工艺中可能存在的 6种有关物质对照品进行收集和分析[16－18]，同时建立了采用HPLC法梯度洗脱测定该药原料药中6种有关物质的方法。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

U3000型高效液相色谱仪（美国戴安公司）；XS105型电子天平（瑞士梅特勒－托利多公司）。

1.2 试药

富马酸替诺福韦二吡呋酯对照品（批号为G0M335，USP，纯 度 为 98.4% ）；杂 质 C（批 号 为R044C0，USP，纯 度 为 100.0% ）；杂 质 D（批 号 为10M090，USP，纯度为 99.9% ）；杂质 E（批号为 1937 －020A7，TLC，纯度为 100.0% ）；杂质 F（批号为 1508 －099A3，TLC，纯 度 为 100.0% ）；杂 质 G（批 号 为R038N0，USP，纯度为 98.0% ）；富马酸对照品（批号为111541－201102，中国食品药品检定研究院，纯度为99.4%）；富马酸替诺福韦二吡呋酯样品（石家庄龙泽制药股份有限公司，批号分别为180101，180102，280201，纯度均为99.8%）；甲醇、叔丁醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Waters Symmery C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm，美国 Waters公司）；流速：1.0 mL ／min；柱温：30 ℃；检测波长：260 nm；流动相：以甲醇 －0.05 mol／L磷酸氢二钠溶液（用磷酸调节 pH 至 5.0）－叔丁醇（15 ∶22 ∶3）为流动相 A，以甲醇 －0.05 mol／L磷酸氢二钠溶液（用磷酸调节 pH 至 5.0）－叔丁醇（30 ∶7 ∶3）为流动相 B，按表1条件进行梯度洗脱。

表1 梯度洗脱条件

2.2 溶液制备

杂质对照品溶液：称取富马酸、杂质 E、杂质 F、杂质G、杂质C、杂质D对照品适量，精密称定，加入流动相A溶解并稀释成各成分质量浓度约为75 μg／mL的溶液，作为杂质对照品贮备液；取该贮备液适量，用流动相A稀释成各成分质量浓度约为0.75 μg／mL的溶液，作为杂质对照品溶液。

供试品溶液：取富马酸替诺福韦二吡呋酯样品，精密称定，加流动相A溶解并稀释成质量浓度为0.5 g／L的溶液，作为供试品溶液。

2.3 方法学考察

系统适用性试验：称取富马酸、杂质 E、杂质 F、杂质G、杂质C、杂质D与富马酸替诺福韦二吡呋酯对照品适量，精密称定，加入流动相A溶解并稀释成各成分质量浓度约为 0.75 μg／mL的溶液，进样测定。系统适用性试验色谱图见图1。

图1 系统适用性试验色谱图

专属性试验：为考察本色谱条件下主峰与各杂质峰的分离情况，对该制剂进行了酸（加1 mol／L盐酸溶液1 mL）、碱（加 1 mol／L 氢氧化钠溶液 1 mL）、高温（105℃）、氧化（加30%过氧化氢1 mL）与光照（置光照度为4 500 lx环境）破坏性试验，分别放置6 h后，按供试品溶液制备方法配制降解产物溶液后进样测定，记录色谱图（见图2）。结果表明，本品在高温、光照条件下较稳定，氧化、酸、碱条件下稍有降解，主成分峰能与降解产物峰良好分离，方法专属性良好，可用于该制剂中有关物质的检测。

图2 专属性试验色谱图

线性关系考察：取各杂质对照品适量，分别配制成质量浓度为 0.375，0.750，3.750，7.500，20.000 μg ／mL的系列溶液，各精密量取 10 μL，按 2.1项下色谱条件检测，记录色谱图，以峰面积（Y）为纵坐标、进样质量浓度（X，μg／mL）为横坐标进行线性回归。结果见表 2。

表2 线性关系考察结果（n＝5）

检出限和定量限测定：取“线性关系考察”项下最低质量浓度的对照品溶液，逐级稀释，按2.1项下色谱条件进行检测。信噪比（S／N）≥3时，富马酸、杂质 D、杂质 E、杂质F的检出限为7.5 ng／mL，杂质C和杂质G的检出限为0.15 μg／mL；S／N≥10 时，富马酸、杂质D、杂质 E、杂质F的定量限为15 ng／mL，杂质C和杂质G的定量限为0.375 μg ／mL。

重复性试验：依法配制供试品溶液6份，按2.1项下色谱条件检测，计算6份供试品溶液中富马酸替诺福韦二吡呋酯主峰面积与称样量的比值（A／m），结果的RSD为0.79%（n＝6），表明方法重复性良好。

精密度试验：依法配制供试品溶液1份，连续进样6次，记录富马酸替诺福韦二吡呋酯主峰面积。结果的RSD为0.46%（n＝6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：依法配制供试品溶液，分别于0，4，8，12，24 h时按2.1项下色谱条件进样检测。结果富马酸替诺福韦二吡呋酯主峰面积的 RSD为0.63%（n＝5），同时没有新杂质产生，表明供试品溶液在24 h内稳定。

回收率试验：依法配制供试品溶液，分别加入不同体积的杂质对照品贮备液，配成含各杂质质量浓度分别为 0.75，1.00，1.50 μg／mL 的溶液，各平行配制 3 份，进样检测，计算回收率。结果见表3。

2.4 样品含量测定

取3批样品，依法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进行测定。试验数据见表4。可见，3批样品种富马酸和杂质E均有检出，表明建立的检测方法可有效控制富马酸替诺福韦二吡呋酯的质量。

3 讨论

3.1 杂质来源分析

分析富马酸替诺福韦二吡呋酯合成生产工艺，确定了6种可能存在的有关物质。富马酸为成盐过程的合成原料；杂质C为替诺福韦，为合成中间体；杂质D为腺嘌呤，为合成原料；杂质 E 为 9－[（R）－2－（羟基）（异丙氧基羰基）氧基]甲氧基]氧膦基]甲氧基]－丙基]腺嘌呤，是替诺福韦二吡呋酯脱去1个异丙氧基羰基氧基甲氧基的反应副产物；杂质F为替诺福韦二吡呋酯中的异丙氧基被乙氧基取代的副产物；杂质G为替诺福韦二吡呋酯脱去一个甲氧基羰基氧基的副产物。可见，有必要对这6种杂质进行质量控制。

表3 各杂质回收率试验结果（%，n＝9）

表4 3批样品含量测定结果（%）

3.2 流动相及检测波长选择

富马酸替诺福韦二吡呋酯和6种有关物质在极性较大的有机溶剂中溶解度好，同时供试品中反应起始物、中间体及副反应产物共涉及6种成分，等度洗脱不易分离且检测时间较长，最后采用反相色谱梯度洗脱进行检测，实现了良好的分离度和适当的检测时间。对富马酸替诺福韦二吡呋酯供试品和6种有关物质的溶液进行全波长紫外扫描，结果显示，检测波长为260 nm时可采用外标法有效地对该6种有关物质进行限量检测。

3.3 方法评价

本试验中建立的测定富马酸替诺福韦二吡呋酯中6种有关物质的HPLC梯度洗脱法，操作简单，专属性强，准确度高，可有效控制该制剂原料药的质量，同时也为该药相关制剂的质量控制提供了参考。