多巴胺受体在胰岛β细胞系和原位组织中的差异性表达

李 季 李广文 张 悦 朱进霞

(首都医科大学基础医学院生理学与病理生理学系，北京 100069)

多巴胺(dopamine, DA)是一种重要的单胺类神经递质，不仅广泛存在于中枢神经系统，在许多外周组织器官也能合成DA，如胃肠道、肾脏、胰腺等，并且参与胃肠动力、离子转运、胰腺内外分泌等功能的调节[1-2]。近年来，越来越多的研究[3-4]表明，DA与血糖调节以及糖尿病之间存在联系。DA通过与其受体结合进而发挥生物学作用，但关于DA受体在胰腺组织和细胞系中的表达分布研究报道并不一致。

2005年，Rubi等[5]在大鼠胰岛β细胞系INS-1E细胞上用免疫荧光方法发现有D2受体的表达，并且激动D2受体会抑制胰岛素的分泌。而笔者前期研究[6]结果显示DA受体D1、D2和D5广泛分布在大鼠胰腺组织的内分泌部，其中D1受体表达在分泌胰岛素的β细胞上，D5受体表达在分泌胰高血糖素的α细胞和分泌胰多肽的PP细胞上，D2受体表达在分泌生长抑素的δ细胞上。还有研究者[7]应用PET/CT显像技术观察到在大鼠胰腺组织中有D2/D3受体表达，但无法明确受体的具体细胞定位。也有文献[8-9]报道在MIN6细胞系(小鼠胰岛β细胞系)上表达D3受体，并且通过影响细胞内Ca2+浓度抑制胰岛素分泌。以上研究结果表明DA受体在胰腺组织中的分布与细胞系存在差异，而细胞系本身又存在肿瘤细胞的特性，与正常细胞存在差异[10]，也提示DA受体在胰腺组织和胰岛β细胞系中可能存在分布差异，同时细胞系的功能与原代也可能存在差异。实验通过研究大鼠胰腺组织和胰岛β细胞系INS-1(大鼠源)和HIT-T15(仓鼠源)细胞中DA受体的分布以及INS-1细胞的内分泌功能，为探究DA调节胰岛β细胞功能以及研究结果不一致的可能原因提供一定的实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

本研究所用实验动物为SPF级雄性Sprague Dawley(SD)大鼠(体质量为200～220 g)，购于首都医科大学实验动物科学部[动物许可证号为：SCXK(京) 2012-0001]，国家级动物饲养环境，动物饲养及操作均严格遵守实验动物福利准则，给予正常昼夜更替光照，24 h自由食水供应。

1.2 组织制备与冰冻切片

SD大鼠急性颈椎脱臼处死，沿腹白线切口，进入腹腔，迅速取出胰腺组织标本，将脂肪等其他组织去除，置于预冷的中性4%(质量分数)多聚甲醛(paraformaldehyde, PFA)溶液中固定。24 h后，取出胰腺组织，入15%(质量分数)的蔗糖溶液脱水，16～18 h后再取出组织，入30%(质量分数)的蔗糖溶液再次进行脱水处理，待组织沉于试管底部，取出组织，去除多余液体后置于充满optimal cutting temperature compound(OCT包埋剂)的包埋盒中并经过液氮固化制备成冰冻组织块-80℃冰箱保存。用Leica冰冻切片机制备5μm厚度的大鼠胰腺组织冰冻切片，组织平整地贴于经过多聚赖氨酸处理后的载玻片上，室温晾干后于-20℃冰箱储存。

1.3 细胞培养与传代

大鼠胰岛β细胞系(INS-1细胞)培养于RPMI-1640完全培养基中，含有10%(体积分数)热灭活的胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)，100 U/ mL青霉素和100 μg/ mL链霉素，2 mmol/L L-谷氨酰胺，10 mmol/L HEPES，1 mmol/L丙酮酸钠，4 500 mg/L葡萄糖和 1 500 mg/L碳酸氢钠。仓鼠胰岛β细胞系(HIT-T15细胞)则置于F-12K完全培养基中，含有10%(体积分数)热灭活的胎牛血清，100 U/ mL青霉素和100 μg/ mL链霉素，2 mmol/L L-谷氨酰胺和1 500 mg/L碳酸氢钠(均来自美国Gibco公司)。在37 ℃，5%(体积分数)CO2的细胞培养箱中培养，之后每2～3 d更换一次培养基。培养皿中细胞密度融合为70%～80%左右时，需进行传代。细胞以2.5×105个细胞/孔的密度接种于24孔板中进行免疫细胞荧光染色，以5.0×106个细胞/孔的密度接种于6孔板中进行胰岛素分泌实验。以上细胞购自美国American Type Culture Collection(ATCC)公司。

1.4 胰腺组织冰冻切片免疫荧光染色

将制备好的组织切片从-20℃取出，在室温晾干，抗原修复后冷却至室温。将切片置于染缸中，磷酸盐吐温缓冲液(phosphate buffered saline-Tween-20，PBST)洗片5 min，共3次，用5%(体积分数)驴血清封闭非特异性抗原30 min，将封闭血清弃去，再滴加Ⅰ抗(用PBST稀释)，湿盒4℃过夜。隔天取出切片，弃去Ⅰ抗，PBST洗5 min，共3次，滴加荧光Ⅱ抗(用PBST稀释)，室温孵育2 h，弃去Ⅱ抗，滴加DAPI染细胞核，室温孵育5 min，PBST洗5 min，共3次，50%(体积分数)甘油封片，荧光显微镜下成像。在滴加荧光Ⅱ抗及之后的步骤注意避光。抗体信息详见表1、2。

1.5 细胞免疫荧光染色

选取培养状态较好的细胞(INS-1、HIT-T15细胞)，弃去培养液，磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)洗2次，每次2 min，之后消化细胞(步骤同前)，取24孔板，每孔加入经过高压灭菌的无菌盖玻片1张，将细胞接种于24孔板中的盖玻片上，每孔加1 mL完全培养基于培养箱[37℃、5%(体积分数)CO2]中过夜培养，待细胞贴壁稳定后进行实验。取出24孔板，弃去培养液，PBS洗2次，每次2 min，加入中性4%(质量分数)PFA固定15 min后，PBST洗 5 min，共3次，之后染色步骤同冰冻切片染色。封片时，将盖玻片有接种细胞的那面用50%(体积分数)甘油贴于载玻片上，荧光显微镜下成像。抗体信息见表1，2。

1.6 INS-1细胞胰岛素分泌实验

INS-1细胞接种至6孔板中，待细胞贴壁稳定后进行实验。过夜培养，每孔培养基更换为 1 mL 的无糖Krebs-Ringer bicarbonate HEPES(KRBH)溶液，在培养箱中[37℃、5%(体积分数)CO2]稳定30 min后，换为1 mL含有 2 mmol/L 葡萄糖的 KRBH 液中继续再孵育培养1 h，每孔取300 μL液体用于胰岛素和胰高血糖素的测定，弃去剩余的KRBH液，之后每孔给予1 mL含有20 mmol/L葡萄糖的KRBH 溶液，孵育1 h后每孔再次留取孵育液体用于胰岛素和胰高血糖素的测定。实验采用放射免疫方法测定孵育液中胰岛素和胰高血糖素的浓度(北方生物技术有限公司)。

表1 实验所用Ⅰ抗信息Tab.1 Information of primary antibody

表2 实验所用Ⅱ抗信息Tab.2 Information of secondary antibody

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 多巴胺受体在大鼠胰腺组织的分布

为了探究DA受体在大鼠胰腺组织中的分布，我们运用免疫荧光双标的实验方法，利用4种胰岛内分泌细胞的标志物的抗体，即胰岛素(insulin, INS)标记β细胞，胰高血糖素(glucagon, GLU)标记α细胞，生长抑素(somatostatin, SST)标记δ细胞和胰多肽(pancreatic polypeptide,PP)标记PP细胞，与不同亚型的DA受体进行免疫荧光染色，并运用激光共聚焦显微镜成像。如图1所示：在大鼠胰腺组织中，DA受体D1、D2和D5分布于胰腺组织的内分泌部的不同细胞上，其中D1受体表达在β细胞上，D2受体表达δ细胞上，D5受体表达在的α细胞和PP细胞上。

2.2 多巴胺受体在胰岛β细胞系INS-1和HIT-T15细胞上的分布

在INS-1细胞中，D1、D2和D5受体均有表达，并且细胞均表达INS免疫阳性，与受体表达存在共定位(图2A)。

在HIT-T15细胞中也观察到3种受体D1、D2和D5的表达(图2B)。以上结果表明，DA受体在胰岛β细胞系中的分布不同于原位的胰岛β细胞。

2.3 INS-1细胞的内分泌功能不同于原位β细胞

实验显示这两种胰岛β细胞系的同一个细胞不仅表现INS免疫阳性，同时也表现GLU免疫阳性(图3A和B)。而在大鼠胰腺组织中，INS和GLU免疫阳性则分别表达在不同的细胞上(图3C)。进一步用放射免疫法测定了 INS-1细胞孵育液(KRBH 缓冲液)中是否含有胰高血糖素。在没有接种INS-1细胞的培养孔中，检测不到胰岛素和胰高血糖素，接种INS-1细胞后，既可检测到胰岛素，也可检测到胰高血糖素，胰岛素浓度会在20 mmol/L高糖刺激下明显升高(t=4.708,P=0.000 8,n=6)，而胰高血糖素的浓度则没有明显变化(t=0.3451,P=0.7418,n=4)，详见表3。

图1 多巴胺受体在大鼠胰腺组织的分布Fig.1 Distribution of dopamine receptors in rat pancreatic islets

Red fluorescence for dopamine receptors, and green fluorescence for INS-, SST-，GLU- and PP-immunoreactivity.Scalebars：100 μm；INS：insulin；SST：somatostatin；GLU：glucagon;PP:pancreatic polypeptide.

图2 多巴胺受体在INS-1和HIT-T15细胞上的表达Fig.2 Distribution of dopamine receptors in INS-1 and HIT-T15 cells

Green fluorescence for dopamine receptors, and red fluorescence for INS-immunoreactivity.A：INS-1 cell;B: HIT-T15 cell；Scalebars：25, 10 μm.INS-1：insulin-1.

图3 INS和GLU在INS-1、HIT-T15细胞和大鼠胰腺组织上的表达Fig.3 Distribution of INS- and GLU-immunoreactivity in INS-1、HIT-T15 cells and rat pancreatic tissue

Green fluorescence staining for INS-immunoreactivity, and red fluorescence staining for GLU-immunoreactivity.A：INS-1 cell;B: HIT-T15 cell;C: Rat pancreatic tissue；Scalebars：100, 25, 10μm；INS-1：insulin-1.

表3 INS-1细胞孵育液中胰岛素和胰高血糖素浓度Tab.3 Insulin and glucagon content in INS-1 cell supernatant

3 讨论

DA及其受体参与胰腺功能调节的作用被广泛研究，尽管其对内分泌的调节作用存在许多争议，但是大量研究[11]都表明DA对胰腺内分泌功能的调节存在关键性作用。本研究基于前期实验结果和文献报道，进一步探究了DA受体在原位胰腺组织和胰岛β细胞系中的分布以及INS-1细胞的内分泌功能。

1977年，Hansen等[12]首次在新鲜分离的小鼠胰岛的匀浆液中检测到DA。Mahony和Feldman等[13]进一步在金黄地鼠的胰岛研究了单胺类递质在胰岛中摄取和作用，但他们也强调，对来自不同物种的胰岛进行实验，其结果存在巨大差异。同样，关于DA受体在不同物种的胰腺组织和细胞系中的表达分布的研究报道也存在差异性。在原位组织中的结果表明，不同DA受体的亚型分布在大鼠胰腺组织的内分泌部中不同的内分泌细胞上[6]。而在不同的胰岛β细胞系的研究中，其研究结果也存在差异性。在大鼠胰岛β细胞系INS-1E细胞上用免疫荧光方法发现有D2受体表达在该细胞上[5]，在MIN6细胞系上表达D3受体[8]。此外，与DA合成和代谢相关基因的mRNA表达水平在小鼠原代分离的胰岛和MIN6细胞中也不一致[9]。笔者在胰岛β细胞系INS-1和HIT-T15观察了DA受体的分布，发现该两种细胞系均同时表达D1、D2和D5受体，与组织中的分布不一致，文献[14]报道，肿瘤细胞的特点本身就与原代细胞存在差异，培养的细胞系中的细胞处于不尽相同的细胞时期，因此可能也具有不同的表现[15]。

此外，肿瘤细胞的微环境也同正常的细胞存在差异，也可能导致肿瘤细胞出现功能性上的差异[16-18]。本实验中也发现这两种胰岛β细胞系同一个细胞不仅表达INS免疫阳性，同时表达GLU免疫阳性，而在原位组织中，INS和GLU免疫阳性则表达在不同的细胞上。进一步在INS-1细胞孵育液中既可以检测到胰岛素，也可以检测到胰高血糖素，提示胰岛β细胞系的内分泌功能不同于原位β细胞。

本研究证明了DA受体在大鼠胰腺组织和胰岛β细胞系中存在差异性分布，胰岛β细胞系内分泌功能也不同于原位β细胞，为研究胰岛β细胞的功能以及DA对胰岛素分泌的调节提供了一定的实验依据。