陈皮、半夏对动脉粥样硬化小鼠PI3K-Akt通路、SOD、MDA、SA-β-gal水平的影响

孙亚男 黄小波 粱 伟 陈文强

(首都医科大学宣武医院中医科，北京 100053)

衰老引起的血管老化在动脉粥样硬化中具有重要作用。血管内皮细胞凋亡是动脉粥样硬化发生的一个始动环节。PI3K-Akt是诱导血管内皮细胞凋亡的关键通路，在动脉粥样硬化病理过程中起着重要的作用。中医认为水谷精微由清化浊，变生痰浊，留滞脉络之中，凝聚成块，是动脉粥样硬化发生的重要因素。而陈皮、半夏作为化痰对药，为多数化痰复方的核心组成药物，有化痰祛湿的功效。本课题组前期研究[1]证明其可以有效抑制动脉粥样硬化的发生。Klotho敲除小鼠是一种基因缺陷小鼠，有着衰老、动脉硬化等特征。因此在本研究中使用陈皮、半夏对动脉粥样硬化动物模型进行干预，研究陈皮、半夏是否通过调控PI3K-Akt通路、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)和β-半乳糖苷酶(senescence-associated beta-galactosidase,SA-β-gal)而干预动脉粥样硬化的发生。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康清洁级Klotho敲除小鼠40只，C57BL/6小鼠10只，雄性，体质量30～50 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号：SCXK(京)2016-0006。所有动物饮水不限，自由摄食，光/暗各12 h。

1.2 陈皮、半夏汤制备

参照本课题组[1]前期研究结果，半夏、陈皮按照1∶1 的比例配伍。参照《中华人民共和国药典》(2010年版)，蒸馏水泡2 h，常法煎煮2次，每次40 min，滤出，60 ℃恒温箱内24 h，水浴蒸发，调整浓度至1 g/mL(相当于生药1 g/mL)。并对pH值、卫生学、比重等进行检测。4℃储存备用，用前摇匀。

1.3 血清制备

Klotho敲除小鼠使用陈皮-半夏汤剂灌胃，于末次给药后1 h麻醉，无菌条件下经腹主动脉采血，室温放置2 h，3 000 r /min 离心10 min，分离得到血清，56℃灭活30 min，分装冻存备用。

1.4 方法

1.4.1Klotho敲除小鼠颈动脉检测

1)实验动物分组及给药：采用数字表法将小鼠随机分为对照组(A组)：C57BL/6小鼠，6周龄(10只)；动脉粥样硬化衰老模型组(B组)：Klotho敲除小鼠(Klotho-/-)，6周龄(10只)；治疗组(C组)：Klotho敲除小鼠，6周龄，陈皮、半夏干预治疗(30只)，按照临床用量的10倍(大剂量，20 g/kg)、5倍(中剂量， 10 g/kg)和、2.5倍(小剂量，5 g/kg)中药用量，分为3个亚组，每组10只。其中，A组予基础饲料喂饲；B、C组予高脂饲料喂饲；C组在高脂饲料喂饲基础上使用陈皮、半夏灌胃给药，每日给药1次，连续6周；A、B组使用等体积0.9%(质量分数)氯化钠注射液灌胃。所有动物饮水不限，自由摄食，光/暗各12 h，每周测体质量一次。使用病理形态学检测方法抽样检验造模情况。

2)HE染色观察颈动脉病理改变：Klotho敲除小鼠，取相同部位颈总动脉，置于4%(质量分数，4℃，pH 7.4)的多聚甲醛中固定24 h，石蜡包埋后以4 μm厚度切片，60～62℃烘箱(DHG-9140A型电热恒温箱)烤片2 h后行HE染色。每组每个标本随机选取1张切片，观察病理改变。

1.4.2 血浆MDA、SOD、SA-β-gal检测

分离血清，检测SOD、MDA。SOD活性检测采用黄嘌呤氧化法，在波长550 nm处比色，按公式计算其活力，SOD活性以每mL反应液中SOD抑制率达50%所对应的SOD量为一个亚硝酸单位。MDA检测采用硫代巴比妥酸法，在波长532 nm处比色，按公式计算其含量。

检测颈动脉SA-β-gal。动脉冰冻切片，置于新鲜配制的SA-β-gal孵育液中：X-gal 1 g/L，40 mmol/L柠檬酸缓冲液，pH 6.0、5 mmol/L K4Fe (CN)6、5 mmol/L K3Fe(CN)6、2 mmol/L MgCl2、150 mmol/L NaCl。37 ℃孵箱过夜，显色，PBS冲洗，10 g/L中性红复染胞核，油镜下观察。

1.4.3 Western blotting法测定颈动脉PI3K与p-Akt表达

RIPA buffer裂解液提取总蛋白，考马斯亮兰法测蛋白含量，调整蛋白浓度，煮沸变性5 min，SDS- PAGE 电泳后半干转印仪转膜，5%(质量分数)脱脂奶粉的TBST[0.05%(体积分数)的Tween-20]封闭1 h，一抗(兔抗PI3K、兔抗Akt、兔抗p-Akt，1∶1 000)，4 ℃ 孵育过夜，二抗羊抗兔IgG(1∶1 000)孵育1.5 h，β-actin为内对照，洗膜，放射自显影1 min，定影、晾干、扫描、图像分析仪对显影带分析。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 中药陈皮、半夏对Klotho敲除小鼠颈动脉病理变化的影响

正常对照组颈动脉血管内膜完整，中膜为梭形平滑肌细胞。模型组有粥样斑块形成，内膜明显增厚，内膜下有大量泡沫细胞堆积。陈皮半夏治疗组内膜也有轻度的增生，内膜下有泡沫细胞形成，程度轻于模型组。随着陈皮半夏用药剂量的增加，动脉粥样硬化程度逐渐减轻。表明陈皮半夏对动脉粥样硬化具有一定的干预作用(图1)。

2.2 中药陈皮、半夏对Klotho敲除小鼠血浆MDA、SOD的影响

模型组与对照组的SOD、MDA、SA-β-gal值差异有统计学意义，说明造模成功，详见表1。

模型组SOD较对照组显著下降(P<0.01)，MDA和SA-β-gal含量显著升高(P<0.01)，表明动物在衰老状态。使用大剂量和中剂量陈皮、半夏干预后，SOD浓度较模型组有显著上升(P<0.01)，MDA和SA-β-gal含量则显著降低(P<0.01)，表明中药陈皮、半夏能够有效延缓动脉衰老，详见表2。

图1 各组小鼠颈动脉的病理变化Fig.1 Pathological changes of carotid artery in mice(HE staining，400×)

表1 对照组与模型组血浆SOD、MDA、颈动脉SA-β-gal含量比较Tab.1 Level of SOD、MDA、SA-β-gal in control group and model group

表2 治疗组与模型组血浆SOD、MDA、颈动脉SA-β-gal含量比较Tab.2 Level of SOD、MDA、SA-β-gal in model group and citrus-pinellia group

2.3 中药陈皮、半夏对Klotho敲除小鼠颈动脉PI3K与p-Akt表达的影响

模型组中，PI3K和p-Akt表达较对照组显著升高(P<0.01)。陈皮、半夏治疗组中各组PI3K和p-Akt表达均较模型组有下降。其中，大剂量和中剂量治疗组中PI3K下降水平与模型组比较，差异有统计学意义(P<0.01)。陈皮、半夏各治疗组p-Akt表达均显著低于模型组，差异有统计学意义(P<0.01)。说明陈皮、半夏对动脉粥样硬化动物的PI3K和p-Akt水平有较好的调控作用(图2)。

3 讨论

内皮细胞的衰老、凋亡所引起的内皮功能障碍在动脉粥样硬化的发生、发展过程中起主要作用。血管的氧化应激和内皮细胞功能的障碍加速了血管衰老的进展[2]。在基因缺失的小鼠中，内皮细胞功能出现障碍，提前出现了动脉粥样硬化，这使小鼠出现了早衰的表现和寿命的缩短[3]。Akt在血管重构的发病机制中起到主要作用，可以通过Akt信号传导而增加细胞存活，在动脉粥样硬化中，Akt通过增加血管平滑肌细胞的增生和存活保护内皮细胞[4-5]。

图2 颈动脉PI3K、Akt和p-Akt表达Fig.2 Expression of PI3K、Akt and p-Akt in carotid artery

△△P<0.01vscontrol group，**P<0.01vsmodel group，1：control group，2：model group，3：citrus-Pinellia high dose，4：citrus-pinellia medium dose，5：citrus-Pinellia low dose.

PI3K/Akt信号转导途径是重要的细胞存激酶途径。PI3K/Akt信号系统广泛分布于多种细胞中，PI3K 通过对磷脂酰肌醇环上的3位羟基进行磷酸化产生磷酸化的磷脂酰肌醇，并与Akt的PH 区结合，导致Akt从细胞质游离至细胞膜，并且构象发生改变，在Ser473和Thr308位点发生磷酸化，形成信号级联复合物，然后通过影响下游多种效应分子的活化状态，而发挥调控内皮细胞凋亡的关键作用[6]。PI3K/AKT信号通路可调控细胞增长、增生、粘附等多种生物学功能。PI3K被激活后，可招募并激活AKT，活化的AKT通过磷酸化作用激活或抑制下游靶蛋白的表达，进而调节细胞的增生及凋亡等过程[7]。

MDA升高可以直接反映其遭受了过度的氧化应激损伤，反之则表明受到氧化应激影响的程度减轻。SOD可以清除细胞内活性氧物质，对细胞维持氧化与抗氧化起重要作用。通过检测细胞内SOD变化可以反映细胞遭受氧化应激的水平[8-10]。已有研究[11-12]证实，细胞内活性氧的增加可引起细胞存活率下降，诱导内皮细胞凋亡，而细胞内活性氧作为重要的细胞内信使，活化AKT、细胞外信号调节激酶等信号转导通路，直接导致细胞凋亡产生。SA-β-gal是衰老细胞的标志之一，增加自由基的清除并有效抑制过度的氧化修饰可延缓动脉粥样硬化的进程。目前，已有大量细胞体外实验[13-14]表明，抗氧化药物是通过激活PI3K/Akt信号转导通路，进而上调SOD活性，起到抗氧化应激的作用，有效防治细胞DNA氧化损伤、线粒体功能障碍、神经细胞凋亡等作用。

陈皮、半夏作为临床常用的化痰对药，具有燥湿化痰的功效，临床应用非常广泛。陈皮长于理气健脾、燥湿化痰、为脾胃气滞、胸脘痞满及痰湿雍滞等常用之品，半夏善于燥湿化痰、降逆止呕，为痰湿阻滞常用药。二药配伍入脾经，半夏得陈皮之气助则气顺而痰自消，化痰湿之力尤胜；陈皮得半夏之辅，则痰除而气自下，理气和胃的功效更显著[15]。《太平惠民和剂局方》中有二陈汤，可以充分体现二药合用之功。现有研究[16]表明，半夏和陈皮的主要成分分别是β-谷甾醇和陈皮苷，具有抗炎、抗癌、抗氧化、抗高血脂和防治高血压等作用。这两者均能抑制黄嘌呤氧化酶/次黄嘌呤体系中产生的超氧阴离子，其清除自由基的能力在一定浓度范围内随着药物浓度的增大而增强，β谷甾醇和陈皮苷都是良好的抗氧化剂，且能较好地清除自由基，增加细胞内活性氧，从而作用于AKT，进而调节细胞的增生和凋亡[11-12，17-20]。

本研究表明，陈皮、半夏治疗能够有效抑制动脉血管内膜增厚，且随着剂量的增加抑制逐渐增强，动脉血管内膜增厚的程度逐渐减轻。SOD亦随着陈皮、半夏剂量的增加而增加，相反，MDA随其增加而降低，SA-β-gal含量也随之降低。说明陈皮、半夏可能通过PI3K-Akt通路增加了细胞内活性氧的水平，从而达到控制细胞的凋亡，进而有效抑制动脉粥样硬化的形成和加重，并且抑制效果与剂量的增加密切相关。

经上述分析，笔者认为陈皮、半夏可能通过PI3K/Akt通路，增加SOD水平，降低MDA、SA-β-gal水平而减少动脉粥样硬化斑块形成，从而延缓衰老形成。