利用双电极电压钳检测rs12899798单核苷酸多态性对α7烟碱受体功能的影响

薛奋勤 薛 冰

(首都医科大学中心实验室,北京 100069)

烟碱型乙酰胆碱受体(nicotinic receptor，nAChR)-α7广泛分布于哺乳动物的大脑中，并在脑功能，尤其是学习和记忆中起重要作用。1个典型的nAChR由5个亚基组成[1]，这5个亚基可以是相同的(如α7)或不同的(如α4β2)。在哺乳动物的大脑中，主要的亚型是α4β2和nAChRs α7[2]。许多其他亚型以不同的α(2～10)和β(2～4)亚基进行组合，从而产生功能多样性的离子通道蛋白。nAChR功能的微小变化，例如单一突变，可能对脑功能具有显著影响[3]。

nAChR α7广泛分布于中枢神经系统和自主神经节。这个受体比其他亚型的nAChR具有更高的钙通透性[4]。除了兴奋性突触传递之外， nAChR α7还在递质释放，神经突生长，神经元存活和凋亡以及神经元可塑性中发挥重要作用[5]。 nAChR α7功能障碍与多种神经和精神疾病有关。

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)是同一物种个体之间DNA序列单碱基的变异。SNP的位置可以位于人类基因组的任何地方。在一个基因内，SNP可以位于内含子或外显子中[6]。单核苷酸的错义突变、插入或缺失将改变蛋白质序列，并且可能影响蛋白质表达和功能。通过检索美国国家生物技术信息中心(National Center of Biotechnology Information, NCBI)的SNP数据库，笔者发现了一个导致α7亚基错义突变的SNP位点W55G，它在受体蛋白上位于配体的结合区域。本研究利用双电极电压钳检测了W55G点突变对α7烟碱受体活化及脱敏等功能特性的影响。

1 材料与方法

1.1 突变体的构建和cRNA制备

将编码人nAChR α7亚基的cDNA克隆到pGEMHE卵母细胞表达载体中。采用基于PCR的定点突变方法(Stratagene公司，美国)构建W55G突变体，并进一步进行测序验证。接下来，将nAChR α7野生型和突变体载体通过NheI酶切而进行线性化后，使用T7 RNA聚合酶通过体外转录法而得到各自的cRNA；用DNA酶将DNA模板降解后，将cRNA纯化并重悬于焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate， DEPC)水中。最后在1%(质量分数)琼脂糖凝胶上查验cRNA产量和完整性,在紫外光光度计(NanoDrop 2000/2000c， Thermo Fisher公司，美国)上测其浓度，并将RNA浓度分别调整至大约1 g/L备用。

1.2 非洲爪蟾卵母细胞制备和cRNA的注射

先用0.2%(质量分数)MS-222麻醉雌性非洲爪蟾，然后将卵巢叶取出并置于孵育缓冲液(82.5 mmol/L NaCl，2.55 mmol/L NaCl，2.5 mmol/L KCl，1 mmol/L MgCl2,1 mmol/L CaCl2,1 mmol/L Na2HPO4,0.6 mmol/L 茶碱，2.5 mmol/L 丙酮酸钠，5 mmol/L HEPES，50 mg/L庆大霉素，50 U/mL青霉素和50 mg/L链霉素，pH值为7.5。将卵巢叶切成小块，并在室温下用胶原蛋白酶消化1.5～2.0 h。选取VI期卵母细胞，用Nanoject微量注射系统(Drummond公司，美国)将cRNA注射其中(每个卵母细胞20～60 nL)，放入16 ℃的生化培养箱中摇荡培养。

1.3 双电极电压钳记录

cRNA注射1～3 d后，室温下(22 ℃)用双电极电压钳记录电流。电极内充灌3 mmol/L 的KCl溶液，使用GeneClamp 500B放大器(Axon Instruments公司，美国)，卵母细胞被钳在-60 mV，以50 Hz对电流信号进行滤波。用Pclamp10.0来分析和处理电流数据。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 W55在α7亚基上的位置

W55在nAChR α7一级结构中和三维结构模型的位置见图1。这个色氨酸残基位于nAChR α7亚基的羧基端的loop D，是一个配体结合位点，在所有神经元nAChR亚基中都是保守的。

图1 W55在nAChR α7一级结构和三维结构模型的位置Fig.1 Location of W55 in the receptor：sequence (loop D) and 3D modelLocation of the W55 in 1D (aligning with nAChR β2) and 3D structure of an nAChR α7 subunit；nAChR：α7 nicotinic receptor.

2.2 W55G突变使nAChR α7 对乙酰胆碱的敏感性降低，但增加了Imax

本研究在非洲爪蟾卵母细胞中表达了W55G突变体，并检测了突变体对受体天然激动剂乙酰胆碱(choline,ACh)的剂量-效应关系。与野生型α7受体相比，需要更高浓度的乙酰胆碱才能刺激突变体受体W55G产生电流(图2A)。突变体W55G的剂量-效应关系见图2B。与野生型α7受体相比，其剂量-效应曲线右移数倍。野生型受体中乙酰胆碱的EC50为(210.5±24.3)μmol/L。相比之下，W55G突变体的EC50为(1 375.3±130.5)μmol/L，突变体对其天然神经递质的敏感性降低6.5倍。

为了进一步检测突变体对ACh的反应变化，在蛙卵中注射相同剂量的RNA,比较了ACh诱导的最大电流(Imax)。在注射2 d后，突变体受体中的Imax(由3.16 mmol/L Ach刺激诱导)显著高于野生型(约6倍)(图2C)。

2.3 W55G突变使nAChR α7 对胆碱的敏感性降低

野生型和突变体W55G对胆碱的电流反应情况见图3A。与野生型受体相比，W55G的剂量-效应曲线明显右移，突变受体对胆碱的敏感性也降低了(图3B)。野生型对胆碱的EC50为(1 466.7±174.3)μmol/L，而W55G的EC50为(4 610.3±188.5)μmol/L，突变受体对胆碱的敏感性降低了约3.14倍。

图2 W55G突变使nAChR α7对乙酰胆碱的敏感性降低Fig.2 W55G mutation reduced ACh sensitivity but with increased ImaxA：raw traces of ACh-induced currents in the oocytes expressing wild type (WT) and W55G mutant with increasing concentrations; B：averaged dose-response relationship of ACh in the two conditions.W55G mutant exhibited a -6.5 folds decrease of the acetylcholine sensitivity， ***P<0.001 vs wild type nAChR receptor; C：Mutant W55G showed significant increase in maximal current；nAChR：α7 nicotinic receptor； ACh：choline.

图3 W55G突变使nAChR α7对胆碱的敏感性降低Fig.3 W55G mutation reduced choline sensitivityA：raw traces of choline-induced currents in the oocytes expressing wild type(WT) and W55G mutant with increasing concentrations; B：averaged dose-response relationship of choline in the two conditions.W55G mutant exhibited a -3.14 folds decrease of the choline sensitivity.***P<0.001 vs nAChR receptor；nAChR：α7 nicotinic receptor.

2.4 W55G突变改变了nAChR的脱敏动力学

本研究比较了nAChRα7野生型和突变体W55G的电流曲线，对于突变体W55G，尽管使用了较高浓度的乙酰胆碱，但其脱敏动力学仍然较野生型受体显慢(图4A)。图4B中拟合得到了通道脱敏的时间常数，结果表明：野生型nAChR α7的时间常数为(173.17±28.08)ms (n=4); W55G突变体的时间常数为(785.49±78.20)ms (n=4)。W55G突变体时间常数明显比野生nAChR更高，其脱敏速率变慢。

3 讨论

本研究发现nAChR α7中SNP导致的W55G突变显著降低了对其天然配体乙酰胆碱和胆碱的敏感性，并且增加了Imax，而且该突变使受体对于乙酰胆碱的脱敏速率变得较慢。这些功能的改变可能重塑突触后反应，对于脑疾病的发生可能会有较大影响。

nAChR α7具有比其他亚型nAChR更高的钙通透性[4]。除了兴奋性突触传递之外，它还在递质释放，神经突生长，神经元存活和凋亡以及神经元可塑性中发挥重要作用[7]。nAChR α7功能障碍与多种神经和精神疾病有关。例如，分析显示nAChR α7可能与精神分裂症有关[8]，nAChR α7蛋白所对应的缺失与癫痫发作和智力低下有关[9-10]。尽管没有关于nAChR α7与阿尔茨海默病的遗传关联的报道，但胆碱能神经元的退化伴随着nAChR的丢失，并且与典型的临床症状相关[11]，例如学习和记忆能力受损，以及认知能力逐渐下降。因此，nAChR功能的微小变化，例如单一突变，可能对认知功能没有显著影响，可能会有缓慢的作用，导致神经元逐渐丧失，随着衰老而变得更加明显。

图4 W55G突变改变了nAChR α7的脱敏动力学Fig.4 W55G mutation altered desensitization kinetics of nAChR α7A：Typical current traces induced by high concentration of Ach (10 mmol/L) for wild type (WT) nAChR α7 and its mutant W55G; B：Current traces were fitted.***P<0.001 vs wild type nAChR α7；nAChR：α7 nicotinic receptor.

SNP是同一物种个体之间DNA序列单碱基的变异。 SNP的位置可以位于人类基因组的任何地方。在一个基因内，SNP可以位于内含子或外显子中。内含子中的SNP可影响RNA剪接效率或改变RNA剪接模式。外显子中的SNP可位于蛋白质编码区或5′/ 3′非翻译区(untranslated region，UTR)中。编码区中的SNP可能导致突变，插入或删除。在nAChR亚基的编码区域中，近一半的突变是同义或沉默突变，DNA序列中突变为相同氨基酸残基的不同密码子。然而，单核苷酸的错义突变，插入或缺失将改变蛋白质序列，并且可能影响蛋白质表达或功能。

色氨酸残基被认为是结合和通道门控中的重要残基。它在所有神经元nAChR亚基中较为保守。然而，在人群中天然存在的W55G突变体没有普遍认可和充分表征。它对受体通道功能的影响不得而知。本研究在体外表达并用双电极电压钳检测nAChR α7突变体的性质，这对接下来研究该突变体对疾病的影响有重要的意义。